Caractérisation biochimique du transporteur IRT1 et de son mécanisme de régulation

Biochemical characterization of the IRT1 transporter and of its regulatory mechanism

• Auteur / Autrice : Virginia Cointry
• Direction : Grégory Vert
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 30/03/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences du végétal : du gène à l'écosystème (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales (Toulouse ; 2010-....) - Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) - Institut de biologie structurale (Grenoble, Isère, France ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté des sciences d’Orsay (Essonne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Sébastien Thomine
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Chloé Zubieta, Youssef Belkhadir, Hugues Nury, Guillaume Lenoir
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Chloé Zubieta, Youssef Belkhadir

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines membranaires

Plantes -- Nutrition

Transport biologique -- Régulation

Mots clés libres

Transport de métaux

IRT1

Acquisition du fer

Protéines membranaires

Metal transport

IRT1

Iron acquisition

Membrane proteins

Résumé

Le fer est un nutriment clé pour tous les organismes vivants et il est impliqué dans de nombreux processus cellulaires. Bien qu'il soit l'un des éléments les plus abondants sur terre, le fer est souvent indisponible car il précipite dans le sol, formant des complexes insolubles. Les plantes absorbent le fer du sol à travers les cellules épidermiques de la racine en utilisant le transporteur de fer IRT1 qui appartient à la famille de transporteurs ZIP largement répandue. Outre le fer, l'IRT1 peut également transporter des métaux non ferreux (Zn, Mn, Co et Cd), que nous appelons également les substrats secondaires. Notre équipe a récemment montré que l'IRT1 agit comme un transcepteur, détectant directement les métaux non ferreux à l'aide d'un motif riche en histidine dans une boucle intracellulaire non structurée (Dubeaux et al., 2018). Brièvement, sous un excès de métal non ferreux, les métaux se lient aux histidines recrutant la kinase CIPK23. La phosphorylation, à son tour, permet le recrutement de la ligase IDF1 E3 qui ubiquitine IRT1 et la cible pour la dégradation par la voie endocytique. À ce jour, nous en savons encore très peu sur les caractéristiques structurelles de l'IRT1, ses mécanismes de transport, la base de la sélectivité de transport de l'IRT1 et les mécanismes moléculaires à l'origine des événements de régulation tels que le recrutement de la kinase CIPK23. Un tel écart existe pour toutes les ZIP eucaryotes. Au cours de ce travail, nous avons initié des étapes cruciales pour réaliser la caractérisation biochimique de cette protéine. Ici, nous sommes les premiers à rapporter avoir établi un protocole optimisé pour l'expression hétérologue, la solubilisation et la purification d'une protéine variante IRT1 dans les cellules de levure. En outre, nous avons déterminé une procédure technique pour l'étude du transporteur IRT1 dans les protéoliposomes. Les deux approches techniques rapportées ici ont jeté les bases de l'avenir de la caractérisation structurelle et mécanique de l'IRT1 et des ZIP eucaryotes en général. L'échantillon généré par notre protocole a abouti à une qualité suffisante pour la caractérisation préliminaire de la structure par microscopie électronique cryogénique en collaboration avec nos collaborateurs. De plus, nous avons pu étudier les propriétés oligomères de l'IRT1 in vitro, en soumettant l'échantillon pur à une chromatographie d'exclusion de taille couplée par fluorescence et à une ultracentrifugation analytique, et par des techniques in vivo telles que la co-immunoprécipitation et la complémentation de fluorescence bimoléculaire. En outre, nous avons étudié la nature du mécanisme moléculaire induit par la liaison du métal sur la boucle de l'IRT1. Nous avons déterminé par dichroïsme circulaire et RMN l'absence de structure tridimensionnelle sur ladite partie de la protéine, même en présence des substrats secondaires qui déclenchent la voie régulatrice de l'IRT1. Nous fournissons ici, des preuves supplémentaires de la liaison des métaux sur la boucle de l'histidine, ainsi qu'une quantification de cette interaction in vitro. De plus, nous avons déduit le rôle d'un résidu d'acide aspartique, également présent dans la boucle de régulation, qui semble avoir un rôle majeur dans la stabilité structurelle de l'IRT1, mais aucun sur la liaison directe du métal.

Iron is a key nutrient for all living organisms and it is involved in many cellular processes. Despite being one of the most abundant elements on earth, iron often is unavailable because it precipitates in soil, forming insoluble complexes. Plants take up iron from the soil through the epidermic cells of the root using the IRT1 iron transporter that belongs to the widely distributed ZIP family of transporters. Aside from iron, IRT1 can also transport non-iron metals (Zn, Mn, Co and Cd), which we also refer to as the secondary substrates. It was recently shown by our team that IRT1 acts as a transceptor, directly sensing non-iron metals using a histidine-rich stretch in an unstructured intracellular loop (Dubeaux et al., 2018). Shortly, under non-iron metal excess, metals bind to the histidines recruiting the CIPK23 kinase. Phosphorylation, in turn, allows the recruitment of the IDF1 E3 ligase that ubiquitinates IRT1 and targets it for degradation through the endocytic pathway. To date, we still know very little about the structural characteristics of IRT1, its transport mechanisms, the basis of IRT1 transport selectivity and the molecular mechanisms driving regulation events such as the recruitment of the CIPK23 kinase. Such a gap exist for all the eukaryotic ZIPs. During the course of this work, we initiated crucial steps for achieving the biochemical characterization of this protein. Here, we are the first to report having established an optimized protocol for the heterologous expression, solubilization and purification of an IRT1 variant protein in yeast cells. Also, we determined a technical procedure for the study of the IRT1 transporter in proteoliposomes. Both technical approaches reported here set ground in the future of the structural and mechanical characterization of IRT1, and eukaryotic ZIPs in general. The sample generated by our protocol resulted in a quality enough for preliminary characterization of the structure by cryogenic electron microscopy together with our collaborators. Additionally, we were able to investigate the oligomeric properties of IRT1 in vitro, by subjecting the pure sample to fluorescent coupled size exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation, and by in vivo techniques such as co-immunoprecipitation and bimolecular fluorescence complementation. Furthermore, we investigated the nature of the molecular mechanism driven by metal binding on the loop of IRT1. We determined by circular dichroism and NMR the absence of tridimensional structure on said portion of the protein, even in presence of the secondary substrates that trigger the regulatory path of IRT1. We provide here, further evidence of metal binding on the histidine loop, as well as a quantification of this interaction in vitro. Additionally, we inferred on the role of an aspartic acid residue, present in the regulatory loop as well, which appears to have a major role in the structural stability of IRT1, but none on the direct metal binding.