Role of caveolae in the regulation of membrane biophysical constraints and involvement in the formation of transendothelial tunnels induced by RhoA inhibition

Rôle des cavéoles dans la régulation des contraintes biophysiques membranaires et implication dans la formation de tunnels transendothéliaux induits par une inhibition de RhoA

• Auteur / Autrice : Camille Morel
• Direction : Emmanuel Lemichez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 13/12/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Pasteur (Paris). Unité Toxines Bactériennes (2017-....)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Microbiologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Martin-Verstraete
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuel Lemichez, Isabelle Martin-Verstraete, Anne Blangy, Pierre Nassoy, Aurélien Roux, Kheya Sengupta, Ewa Paluch, Cécile Leduc
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Blangy, Pierre Nassoy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Endothélium

ADP-Ribosylation

Cavéoles

Endothélium

Toxines

Mots clés libres

Caveolae

RhoA

Mono-ADPribosylation

Toxine

Endothélium

Cavéoline 1

Cavine 1

Macro-Ouverture transendothéliale

Tem

Tension membranaire

Rigidité de flexion de la membrane

Caveolae

RhoA

Mono-ADPribosylation

Toxin

Endothelium

Caveolin1

Cavin1

Transendothelial macroaperture

Tem

Membrane tension

Membrane bending rigidity

Résumé

Plusieurs pathogènes bactériens compromettent la fonction de barrière endothéliale en déclenchant l'ouverture de tunnels transendothéliaux (TEM) d'un diamètre pouvant atteindre 20 'm. In vivo, ce phénomène a été associé à la dissémination de Staphylococcus aureus exprimant l'inhibiteur de la différenciation de l'épiderme (EDIN) par voie hématogène et à l'apparition d'un œdème gélatineux induit par la toxine œdematogène de Bacillus anthracis. L'ouverture des TEMs se produit en en réponse à l'étalement des cellules endothéliales, en raison d'une relaxation du cytosquelette d'actomyosine induite par l'inhibition de la GTPase RhoA. Le principe physique du démouillage de liquides visqueux offre un cadre théorique qui décrit les forces mécaniques sous-jacentes à l'ouverture et l'élargissement des TEM. Dans ce modèle, l'étalement des cellules intoxiquées par l'EDIN augmente la tension membranaire, ce qui conduit à l'ouverture du TEM. L'élargissement des tunnels TEM est ensuite limité par la rigidité de la membrane. Il est bloqué grâce à la formation d'un câble d'actomyosine rigide, piloté par l'ezrin. La formation des TEMs induit une combinaison de courbures positives et négatives de la membrane, qui est détectée par les protéines du domaine I-BAR MIM/ABBA. Leur accumulation autour des TEMs déclenche une polymérisation de l'actine pilotée par ARP2/3 qui conduit à l'expansion des ondes membranaires pour une fermeture des tunnels. Les cavéoles sont des invaginations de la membrane plasmique connues pour se déployer immédiatement en réponse à l'augmentation de la tension membranaire. Dans ce travail, nous avons étudié l'implication des composants des cavéoles, notamment caveolin1 (cav1) et cavin1, dans la nucléation et l'ouverture des TEMs. Nous rapportons la présence de cavéoles sur la face ventrale de la membrane plasmique de cellules endothéliales traitées à l'ExoC3, bien qu'on mesure une diminution de leur densité d'un facteur 2. Par une approche d'inactivation de gène par siRNA, nous avons ensuite établi l'importance de CAV1 et PTRF/Cavin1 dans le control de la proportion de cellules présentant des TEMs et de la densité de TEMs par cellule. Ceci est en accord avec les données montrant l'importance de cav1 et cavin1 dans la prévention de l'étalement des cellules. En utilisant une approche quantitative d'analyse de la dynamique des TEMs, nous enregistrons une augmentation majeure de la vitesse d'ouverture des TEMs et par conséquent de leur taille maximale dans les cellules siCAV1, par rapport aux conditions contrôle et de déplétion PTRF. Les données interprétées par le modèle théorique de mouillage cellulaire, montrent que la déplétion de cav1 augmente la tension effective de la membrane d'un facteur 2 et réduit la rigidité effective de courbure d'un facteur 3, par rapport au contrôle. La diminution d'un facteur 1,5 de la rigidité de flexion de la membrane dans les HUVECs déplétée en PTRF peut probablement être attribuée à une diminution concomitante du niveau de cav1. En parallèle, nous avons mesuré une diminution du volume cellulaire et donc de la hauteur des cellules dans les conditions siCAV1 et siPTRF, ce qui favorise probablement l'apposition des membranes pour la nucléation des TEMs et explique une augmentation de la densité des TEMs dans ces conditions. En conclusion, nous élucidons un nouveau rôle de la cavéoline1 indépendant de la formation des cavéoles qui restreint spécifiquement l'élargissement des TEMs probablement par son insertion dans le feuillet interne de la membrane plasmique.

Several bacterial pathogens compromise the endothelial barrier function by triggering the opening of transendothelial (TEM) tunnels up to 20 'm wide. In vivo, this phenomenon has been associated with the dissemination of Staphylococcus aureus expressing the epidermal differentiation inhibitor (EDIN) via the hematogenous route and the appearance of gelatinous edema induced by the edema toxin from Bacillus anthracis. The opening of TEMs occurs concurrently to the spreading of endothelial HUVEC cells due to a relaxation of the actomyosin cytoskeleton induced by the inhibition of the small GTPase RhoA. The physical principle of liquid dewetting offers a theoretical framework that describes primary mechanical forces underlying the opening and widening of TEMs. In this model, the spreading of EDIN-intoxicated cells increases the membrane tension, leading to the opening of TEM. Then, enlargement of TEM tunnels is limited by the membrane rigidity and blocked thanks to the formation of an ezrin-driven formation of stiff actomyosin cable that accounts for line tension forces. TEM formation induces a combination of positive and negative membrane curvatures, which is sensed by the I-BAR domain proteins MIM/ABBA. Their accumulation around TEMs triggers an ARP2/3-driven actin polymerization leading to membrane wave expansion and resealing of tunnels. Caveolae are cup-shaped invaginations of the plasma membrane known to deploy immediately in response to the increase of membrane tension. In this work, we have investigated the involvement of caveolae components, notably caveolin1 (cav1) and cavin1, for nucleation and opening of TEMs. We report the presence of caveolae pits at the ventral side of the plasma membrane of endothelial cells subjected to ExoC3, although with a 2-fold decrease in their density. By a siRNA-based approach, we then established the importance of CAV1 and CAVIN1 in limiting the proportion of cells with TEMs and density of TEMs per cell. This aligns well with data showing the importance of caveolin1 and cavin1 in preventing the spreading of cells. Using a quantitative approach of TEM dynamics analysis, we record a dramatic increase of the speed of opening of TEMs and consequently their maximal size in siCAV1 cells, as compared to control and CAVIN1 KD conditions. Data framed in the theoretical cellular dewetting model, show that silencing of caveolin1 increases the effective membrane tension by 2-fold and reduces the effective bending rigidity by 3-fold, compared with control. The 1.5-fold decrease of membrane bending rigidity in siPTRF HUVECs can likely be attributed to a concomitant decrease of caveolin1 protein level. In parallel, we have measured a decrease of cell volume and therefore cell height in both siCAV1 and siCAVIN conditions, which likely promote the apposition of membranes for nucleation of TEMs and account for an increase of TEM density in these conditions. In conclusion, we elucidate a new role of caveolin1 independent from the formation of caveolae that specifically restrains the widening of TEMs possibly through its insertion in the inner leaflet of the plasma membrane.