Étude du rôle de la protéine RACK1 et de ses partenaires cellulaires dans l'infection par le virus de la dengue

Résumé

Le virus de la dengue (DENV) est un virus réémergent transmis par le moustique tigre et responsable de pathologies sévères potentiellement mortelles chez l'Homme. A ce jour, il n'existe aucun vaccin préventif ou traitement antiviral curatif efficace contre cet arbovirus, ce qui est dû en partie à une compréhension encore incomplète de son cycle infectieux. Le DENV est un parasite intracellulaire obligatoire qui dépend entièrement des facteurs cellulaires de son hôte pour se multiplier. Cette « dépendance cellulaire » constitue un talon d'Achille du virus qui peut être exploitée pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels la protéine cellulaire RACK1 facilite l'infection de cellules humaines par DENV. RACK1 est une protéine cellulaire cytoplasmique qui a été récemment identifié par mon laboratoire d'accueil comme un composant du complexe de réplication du DENV, une structure multi protéique essentielle à l'amplification du génome du virus. Les études fonctionnelles de mon laboratoire d'accueil ont montré que RACK1 agissait comme un facteur proviral du DENV, cependant son rôle exact dans le mécanisme de réplication virale reste encore mal compris. RACK1 est une protéine d'échafaudage dont la forme majoritaire liée à la sous unité 40S du ribosome participe à la régulation de la traduction des ARNm et dont la forme minoritaire non ribosomale est impliquée dans la réponse immunitaire et la voie des interférons. Dans une première partie de mon travail, j'ai validé à l'aide de cellules éditées pour le gène RACK1 par la méthode CRISPR Cas9, l'importance de ce facteur cellulaire dans le cycle infectieux du DENV. J'ai pu ensuite montrer au moyen d'un mutant de RACK1 défectueux dans sa liaison au ribosome que l'interaction de RACK1 avec la sous unité 40S est cruciale pour l'infection par DENV. RACK1 étant une protéine d'échafaudage, nous avons émis l'hypothèse que sa fonction provirale sur le DENV pourrait dépendre de sa capacité à recruter des facteurs de l'hôte décisifs dans le bon déroulement du mécanisme de réplication virale. Dans une deuxième partie de mon travail, j'ai utilisé une approche de spectrométrie de masse pour caractériser l'interactome de RACK1 et identifier plus de 130 protéines cellulaires liant cette protéine ribosomale. Pour mieux définir la fonction de ces interactants de RACK1 sur la biologie du DENV, nous avons éteint leur expression par interférence ARN dans deux lignées cellulaires et déterminé les conséquences sur l'infection virale. Ce crible génétique a permis d'identifier les protéines Vigilin et SERBP1, deux facteurs de liaison de l'ARN, comme de nouveaux facteurs de dépendance du DENV. Dans une troisième partie, j'ai caractérisé le rôle accompli par ces deux protéines dans le cycle infectieux du DENV. J'ai généré des cellules dont l'expression de Vigilin et SERBP1 a été invalidé par CRISPR cas9 et montré que ces molécules agissaient à l'étape d'amplification de l'ARN viral du DENV sans affecter sa stabilité. J'ai finalement identifié les régions de Vigilin et SERBP1 importantes pour l'interaction avec RACK1 et montré que des protéines Vigilin et SERBP1 mutées au niveau du motif d'interaction avec RACK1 sont incapable de médier la réplication du DENV. L'ensemble de ces résultats montre que RACK1 forme un complexe ternaire avec Vigilin /SERP1 et l'ARN viral pour faciliter la réplication virale du DENV. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'améliorer nos connaissances sur le cycle infectieux d'un arbovirus majeur en santé publique, le DENV. Mes résultats suggèrent que RACK1, Vigilin et SERBP1 régulent l'étape de réplication virale en facilitant la liaison des ARN viraux aux ribosomes pour optimiser la synthèse de nouvelles protéines virales.

mots clés

Titre traduit

Study of the role of the protein RACK1 and its cellular partners in the infection by the dengue virus
Résumé

The dengue virus (DENV) is a re-emerging virus transmitted by the tiger mosquito and responsible for severe and potentially fatal pathologies in humans. To date, there is no preventive vaccine or effective curative antiviral treatment against this arbovirus, which is partly due to a still incomplete understanding of its infectious cycle. DENV is an obligate intracellular parasite that depends entirely on the cellular factors of its host to multiply. This "cell dependence" forms an Achilles heel of the virus that can be exploited to develop new therapeutic strategies. My thesis work focused on the study of the cellular and molecular mechanisms by which the RACK1 cellular protein facilitates the infection of human cells by DENV. RACK1 is a cytoplasmic cellular protein that was recently identified by my host laboratory as a component of the DENV replication complex, a multi-protein structure essential for amplification of the virus genome. Functional studies in my host laboratory have shown that RACK1 acts as a proviral factor for DENV, however its exact role in the mechanism of viral replication is still poorly understood. RACK1 is a scaffold protein whose majority form linked to the 40S subunit of the ribosome participates in the regulation of mRNA translation and whose non-ribosomal minority form is involved in the immune response and the interferon pathway. In the first part of my work, I validated, using cells edited for the RACK1 gene by the CRISPR Cas9 method, the importance of this cellular factor in the infectious cycle of DENV. I was then able to show using a mutant of RACK1 defective in its binding to the ribosome that the interaction of RACK1 with the 40S subunit is crucial for DENV infection. Because RACK1 is a scaffold protein, we hypothesized that its proviral function on DENV may depend on its ability to recruit host factors critical to the proper functioning of the viral replication mechanism. In a second part of my work, I used a mass spectrometry approach to characterize the interactome of RACK1 and identify more than 130 cellular proteins binding this ribosomal protein. To better define the function of these RACK1 interactants on DENV biology, we shut down their expression by RNA interference in two cell lines and determined the consequences on viral infection. This genetic screen identified the Vigilin and SERBP1 proteins, two RNA binding factors, as new DENV dependency factors. In a third part, I characterized the role performed by these two proteins in the infectious cycle of DENV. I generated cells whose expression of Vigilin and SERBP1 was invalidated by CRISPR cas9 and showed that these molecules act in the amplification stage of DENV viral RNA without affecting its stability. I finally identified the regions of Vigilin and SERBP1 important for the interaction with RACK1 and showed that Vigilin and SERBP1 proteins mutated at the RACK1 interaction motif are unable to mediate DENV replication. Taken together, these results show that RACK1 forms a ternary complex with Vigilin / SERBP1 and viral RNA to facilitate viral replication of DENV. In conclusion, my thesis work has improved our knowledge of the infectious cycle of a major arbovirus in public health, DENV. My results suggest that RACK1, Vigilin and SERBP1 regulate the stage of viral replication by facilitating the binding of viral RNAs to ribosomes to optimize the synthesis of new viral proteins.