Thèse soutenue

Étude du rôle de la protéine RACK1 et de ses partenaires cellulaires dans l'infection par le virus de la dengue
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Auteur / Autrice : Alexis Brugier
Direction : Ali Amara
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biothérapies et biotechnologies
Date : Soutenance le 15/12/2021
Etablissement(s) : Université Paris Cité
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génomes, biologie cellulaire et thérapeutiques (Paris ; 2009-....)
Jury : Président / Présidente : Alessia Zamborlini
Examinateurs / Examinatrices : Ali Amara, Alessia Zamborlini, Damien Vitour, Carine Meignin, Sébastien Pfeffer, Valérie Choumet
Rapporteurs / Rapporteuses : Damien Vitour, Carine Meignin

Résumé

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Le virus de la dengue (DENV) est un virus réémergent transmis par le moustique tigre et responsable de pathologies sévères potentiellement mortelles chez l'Homme. A ce jour, il n'existe aucun vaccin préventif ou traitement antiviral curatif efficace contre cet arbovirus, ce qui est dû en partie à une compréhension encore incomplète de son cycle infectieux. Le DENV est un parasite intracellulaire obligatoire qui dépend entièrement des facteurs cellulaires de son hôte pour se multiplier. Cette « dépendance cellulaire » constitue un talon d'Achille du virus qui peut être exploitée pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Mon travail de thèse s'est focalisé sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels la protéine cellulaire RACK1 facilite l'infection de cellules humaines par DENV. RACK1 est une protéine cellulaire cytoplasmique qui a été récemment identifié par mon laboratoire d'accueil comme un composant du complexe de réplication du DENV, une structure multi protéique essentielle à l'amplification du génome du virus. Les études fonctionnelles de mon laboratoire d'accueil ont montré que RACK1 agissait comme un facteur proviral du DENV, cependant son rôle exact dans le mécanisme de réplication virale reste encore mal compris. RACK1 est une protéine d'échafaudage dont la forme majoritaire liée à la sous unité 40S du ribosome participe à la régulation de la traduction des ARNm et dont la forme minoritaire non ribosomale est impliquée dans la réponse immunitaire et la voie des interférons. Dans une première partie de mon travail, j'ai validé à l'aide de cellules éditées pour le gène RACK1 par la méthode CRISPR Cas9, l'importance de ce facteur cellulaire dans le cycle infectieux du DENV. J'ai pu ensuite montrer au moyen d'un mutant de RACK1 défectueux dans sa liaison au ribosome que l'interaction de RACK1 avec la sous unité 40S est cruciale pour l'infection par DENV. RACK1 étant une protéine d'échafaudage, nous avons émis l'hypothèse que sa fonction provirale sur le DENV pourrait dépendre de sa capacité à recruter des facteurs de l'hôte décisifs dans le bon déroulement du mécanisme de réplication virale. Dans une deuxième partie de mon travail, j'ai utilisé une approche de spectrométrie de masse pour caractériser l'interactome de RACK1 et identifier plus de 130 protéines cellulaires liant cette protéine ribosomale. Pour mieux définir la fonction de ces interactants de RACK1 sur la biologie du DENV, nous avons éteint leur expression par interférence ARN dans deux lignées cellulaires et déterminé les conséquences sur l'infection virale. Ce crible génétique a permis d'identifier les protéines Vigilin et SERBP1, deux facteurs de liaison de l'ARN, comme de nouveaux facteurs de dépendance du DENV. Dans une troisième partie, j'ai caractérisé le rôle accompli par ces deux protéines dans le cycle infectieux du DENV. J'ai généré des cellules dont l'expression de Vigilin et SERBP1 a été invalidé par CRISPR cas9 et montré que ces molécules agissaient à l'étape d'amplification de l'ARN viral du DENV sans affecter sa stabilité. J'ai finalement identifié les régions de Vigilin et SERBP1 importantes pour l'interaction avec RACK1 et montré que des protéines Vigilin et SERBP1 mutées au niveau du motif d'interaction avec RACK1 sont incapable de médier la réplication du DENV. L'ensemble de ces résultats montre que RACK1 forme un complexe ternaire avec Vigilin /SERP1 et l'ARN viral pour faciliter la réplication virale du DENV. En conclusion, mes travaux de thèse ont permis d'améliorer nos connaissances sur le cycle infectieux d'un arbovirus majeur en santé publique, le DENV. Mes résultats suggèrent que RACK1, Vigilin et SERBP1 régulent l'étape de réplication virale en facilitant la liaison des ARN viraux aux ribosomes pour optimiser la synthèse de nouvelles protéines virales.