Infection des cellules endothéliales humaines par le virus Zika : rôle des claudines dans l'infection et comme modèles de développement de molécules thérapeutiques

Zika virus infection of human endothelial cells : claudins as infection factors and template for antiviral drug development

• Auteur / Autrice : Jim Zoladek
• Direction : Philippe Afonso
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 01/10/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité d'Epidémiologie et physiopathologie des virus oncogènes (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Van der Werf
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvie Van der Werf, Sandra Martin-Latil, Sara Salinas, Vincent Maréchal, Pierre-Olivier Couraud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sandra Martin-Latil, Sara Salinas

Mots clés

Mots clés contrôlés

immunologie

Claudines

Cellules endothéliales

Barrière hématoencéphalique

Maladies neurologiques

Virus Zika

Mots clés libres

Flavivirus

Virus Zika

Infection

Endothélium

Barrière hémato-encéphalique

Claudine

Peptide antiviral

Flavivirus

Zika virus

Infection

Endothelium

Blood-brain barrier

Claudin

Antiviral peptide

Résumé

Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus du genre Flavivirus et de la famille des Flaviviridae. Son émergence dans la région Pacifique et en Amérique depuis 2007 a permis d'établir un lien entre l'infection par ZIKV et des pathologies neurologiques, telles que le syndrome de Guillain-Barré et la microcéphalie liée à Zika. Ces pathologies sont associées à la détection de virus dans le système nerveux central (SNC) des patients, ce qui traduit une capacité neuroinvasive du virus. Le SNC est protégé contre les pathogènes présentes dans le sang par un ensemble d'interfaces dont la barrière hémato-encéphalique (BHE). Celle-ci est constituée de différents types cellulaires dont des cellules endothéliales qui forment un capillaire continu à jonctions serrées. L'infection productive des cellules endothéliales cérébrales pourrait constituer un des mécanismes du franchissement de la BHE et donc de la neuroinvasion. Nous nous sommes donc intéressés à l'infection des cellules endothéliales cérébrales par le ZIKV. Nous avons mis en évidence une sensibilité différentielle à l'infection par le ZIKV in vitro des cellules endothéliales cérébrales humaines de la lignée hCMEC/D3 en comparant deux milieux de culture commerciaux. Nous avons observé que le gène codant la claudine-7 (CLDN7) est surexprimé dans les conditions favorisant l'infection. De plus, la baisse d'expression (Knock Down, KD) de CLDN7 par transduction de shARN dans ces cellules à l'aide de vecteurs lentiviraux, réduit la sensibilité au ZIKV. Nous avons confirmé ces observations sur d'autres modèles de cellules endothéliales (de cordon ombilical ou de moelle osseuse). Nous avons observé que, malgré une différence de sensibilité à l'infection des cellules CLDN7-KD, leurs capacités d'adsorption et d'internalisation des particules virales étaient conservées. Ceci suggère donc que CLDN7 participerait aux étapes tardives de l'infection dans les cellules endothéliales (au niveau du sorting des endosomes ou de la fusion avec la membrane cellulaire). En revanche, le KD de CLDN7 n'a eu aucun effet sur l'infection de cellules épithéliales, suggérant des phénomènes de compensation ou l'implication d'autres voies d'infection dans ces tissus. Forts de ces observations, nous avons étudié la capacité de peptides dérivés de séquences de claudines (CLDN1 et CLDN7) à inhiber l'infection par le ZIKV. Nous avons montré que des peptides correspondants à l'extrémité N-terminale des claudines ont un effet inhibiteur sur l'infection. Nos résultats suggèrent que ces peptides inhibent la fusion des membranes en interagissant avec le virion. Nous avons également démontré que ces peptides ont un large spectre d'action antivirale, car ils permettent in vitro d'inhiber l'infection par d'autres Flavivirus tels que le virus de la fièvre jaune ou le virus de l'encéphalite japonaise. Notre travail a permis de mettre en évidence l'importance de CLDN7 dans l'infection par le ZIKV ; le rôle des claudines n'avait pas été montré à ce jour pour ce virus. De plus, notre caractérisation d'un peptide antiviral à large spectre contribue à une meilleure compréhension des mécanismes d'infection et pourrait servir de base de développement de molécules thérapeutiques.

Zika virus (ZIKV) is an arbovirus belonging to the Flavivirus genus of the Flaviviridae family. ZIKV emergence in the Pacific islands and in the Americas in the xxx led to demonstrate that ZIKV infection was associated with several neuropathologies including Guillain-Barré syndrome and Zika congenital syndrome. During these pathologies, ZIKV is detected in the central nervous system (CNS) evidencing the neuroinvasive capacity of the virus. The CNS is protected against blood-borne pathogens by several anatomical barriers including the blood-brain barrier (BBB), which is composed of different cell types including endothelial cells that form a continuous capillary sealed with tight-junctions. Crossing the BBB could be the result of the productive infection of these endothelial cells. Hence, we focused our study on the mechanisms of such an infection. In vitro, we found a differential susceptibility to ZIKV infection of a human brain microvascular endothelial cell line (hCMEC/D3) in two commercially available culture media. We discovered that the gene coding for claudin-7 (CLDN7) was overexpressed when the cells were the most susceptible to ZIKV infection. Moreover, the knock down (KD) of CLDN7 using lentiviral vectors containing shRNAs reduced the susceptibility to ZIKV infection. We confirmed these findings in other endothelial cells originating from umbilical or the bone marrow veins. Interestingly, even if susceptibility to the infection was altered in CLDN7-KD cells, their ability to bind and internalize viral particles remained unchanged. This suggests that CLDN7 is involved in late steps of the infection (sorting of virions within in the endosomal network or viral fusion to the endosomal membrane). On the contrary, CLDN7-KD had no effect on epithelial cells, suggesting compensation mechanisms or other pathways of infection in these tissues. Based on these observations, we next studied claudin-derived (CLDN1 and CLDN7) peptides and their ability to inhibit ZIKV infection. We discovered that claudin N-terminus-derived peptides had inhibitory properties. Our results suggest that these peptides inhibit viral fusion by directly interacting with the viral particles. We also found that the peptides were broad-spectrum antivirals since they can inhibit in vitro infection of other flaviviruses (i.e. yellow fever virus and Japanese encephalitis virus). This work lead to the discovery of CLDN7-involvement in ZIKV infection, the role of claudins had not been shown for ZIKV. Moreover, our characterization of a broad-spectrum inhibitory peptide helps in the understanding of the infection mechanisms and could serve as a template for therapeutic drug development.