Régulation post-transcriptionnelle par le dégradosome à ARN chez le pathogène gastrique Helicobacter pylori

Post-transcriptional regulation by the RNA degradosome of the gastric pathogen Helicobacter pylori

• Auteur / Autrice : Alejandro Tejada Arranz
• Direction : Hilde De Reuse
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 29/01/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité de Pathogenèse de Helicobacter (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Microbiologie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Martin-Verstraete
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Martin-Verstraete, Peter Redder, David Lalaouna, Cynthia Sharma, Tâm Mignot
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Peter Redder, David Lalaouna

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ribonucléases

ARN -- Modifications posttranscriptionnelles

Génétique

Infections à Helicobacter pylori

ARN messagers

Mots clés libres

Dégradosome à ARN

Régulation post-transcriptionnelle

ARN

Localisation subcellulaire

Modifications post-traductionnelles

Helicobacter pylori

RNA degradosome

Post-transcriptional regulation

RNA

Subcellular localization

Post-translational modifications

Helicobacter pylori

Résumé

Helicobacter pylori est une bactérie pathogène qui colonise l'estomac de la moitié de la population humaine mondiale. Cette infection est responsable de gastrites, d'ulcères et d'adénocarcinomes qui entrainent 800.000 morts chaque année. Au laboratoire, nous étudions les mécanismes qui permettent à H. pylori de coloniser l'estomac de manière persistante. La régulation post-transcriptionnelle est un niveau majeur du contrôle de l'expression génique. Cette régulation dépend en grande partie de complexes multi-protéiques comportant des ribonucléases. Ces complexes sont nommés dégradosomes à ARN chez les bactéries, et qui jouent un rôle central dans la dégradation et la maturation des ARN. Notre laboratoire a mis en évidence l'existence, chez H. pylori, d'un dégradosome à ARN minimaliste composé de RNase J, une endoexoribonucléase 5'-3' et d'une hélicase à ARN de type DEAD-box, RhpA. Ce complexe joue un rôle majeur dans la dégradation des ARNm chez H. pylori. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au fonctionnement et à la régulation de cette machine moléculaire chez H. pylori. Tout d'abord, l'analyse de la localisation subcellulaire de RNase J et de RhpA chez H. pylori a révélé que ces protéines sont associées à la membrane interne. La protéine RNase J-GFP forme des clusters que nous avons caractérisés par microscopie à super-résolution et qui sont régulés par la concentration cellulaire d'ARN libre. Nous postulons que, chez H. pylori, ces clusters membranaires correspondraient à la forme active du dégradosome à ARN. Ensuite, plusieurs sites d'acétylation de RNase J ont été mis en évidence chez H. pylori, suggérant que le dégradosome à ARN est également régulé au niveau post-traductionnel. Nous avons montré que l'acétylation de la lysine 649 influence l'oligomérisation et l'activité de RNase J in vitro. De plus, la substitution de différents résidus acétylés par des alanines produit, chez H. pylori, des défauts d’activité de RNase J qui se traduisent par une morphologie aberrante de H. pylori. Finalement, par des tests de double hybride, nous avons identifié un nouvel interactant de RhpA, l'exoribonucléase 3'-5' RNase R. Cette interaction a été validée in vitro et chez H. pylori. A la différence de la protéine RNase R de E. coli, la protéine HpRNase R ne présente ni les domaines hélicase à ARN ni l'activité correspondante. Nous avons montré que HpRNase R et RhpA forment un complexe fonctionnel in vitro. Nous postulons que chez H. pylori et d’autres bactéries du phylum Campylobacterota, auquel elle appartient, la protéine RNase R a « coopté » la protéine RhpA pour compenser son absence d'activité hélicase. En conclusion, nous avons mis en évidence, chez H. pylori, différentes propriétés originales du dégradosome à ARN et de ses partenaires révélant ainsi des nouveaux modes de régulation de cette importante machine moléculaire.

Helicobacter pylori is a bacterial pathogen that chronically colonizes the stomach of half of the human population and causes gastritis that can evolve into gastro-duodenal ulcers, MALT lymphoma or gastric adenocarcinoma that leads to more than 800,000 deaths/year. In the laboratory, we study the mechanisms that allow H. pylori to adapt to the stomach and persistently colonize it. Post-transcriptional regulation is a major level of control of gene expression that relies on multi-protein complexes, some of which include ribonucleases and, in bacteria, are called RNA degradosomes, central for RNA processing and degradation. Our lab previously established that H. pylori possesses a minimal RNA degradosome, composed of the essential endo- and 5'-3' exoribonuclease RNase J and the DEAD-box RNA helicase, RhpA. This complex plays a major role in mRNA decay. During my PhD work, different aspects of the functioning of this molecular machine were addressed. Firstly, the subcellular localization of RNase J and RhpA in H. pylori was found to be membrane-associated by cellular fractionation and Western blot. In addition, we showed that the RNase J-GFP protein assembles into clusters that we characterized by super-resolution microscopy and that we found to be regulated by the amount of free RNA inside the cell. We postulate that the RNA degradosome forms active clusters at the membrane. Second, RNase J was shown to be acetylated at multiple sites in H. pylori, suggesting that the RNA degradosome is post-translationally regulated. Acetylation of RNase J at lysine 649 was shown to modulate the oligomerization state and activity of RNase J in vitro, and replacement by alanine of other acetylated residues led to deficient RNase J variants which affect H. pylori cell morphology. Lastly, using bacterial two hybrid, we identified an additional interactor of RhpA, the 3'-5'exoribonuclease RNase R. This interaction was validated in vitro and in H. pylori. HpRNase R was demonstrated to lack helicase domains and activity, which are both features of E. coli RNase R. We found that HpRNase R and RhpA form a functional complex in vitro. We propose that in H. pylori and other members of the Campylobacterota, RNase R has co-opted the RhpA protein to compensate for the loss of its helicase activity. In conclusion, we have unraveled several original properties of the H. pylori RNA degradosome and of its partners that point to multiple levels of regulation of this important molecular machine machinery.