Etude in vitro et in vivo des effets du Lévétiracétam sur la microglie activée au cours du sepsis

In vitro and in vivo study of the effects of Levetiracetam on activated microglia during sepsis

• Auteur / Autrice : Renaud Fleurance
• Direction : Tarek Sharshar
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 25/03/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité neuropathologie expérimentale (Paris ; 2010-2021)
• Jury : Président / Présidente : Martine Cohen-Salmon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Tarek Sharshar, Martine Cohen-Salmon, Jan Pieter Konsman, Laurent Chatre, Stéphane Hunot, Pierre-Olivier Couraud, Vincent Degos
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Martine Cohen-Salmon, Jan Pieter Konsman

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lévétiracétam

Encéphalopathie associée au sepsis

Reprogrammation cellulaire

Morphologie (biologie)

Microglie

Neuro-inflammation

Mots clés libres

Modulation pharmacologique

Reprogrammation métabolique

Sepsis associated encephalopathy

Neuroinflammation

Microglial cell

Pharmacological modulation

Levetiracetam

Morphology

Metabolic reprogramming

Résumé

Le sepsis est l'association d'une infection et d'une défaillance d'organes consécutive à une dysrégulation de la réponse de l'hôte. Sa prise en charge est un enjeu majeur de santé publique du fait de sa forte incidence mondiale (plus de 30 millions par an) et de sa surmortalité atteignant 60% lors de choc septique. L'une des défaillances d'organe les plus fréquentes est une encéphalopathie qui se caractérise essentiellement par des troubles de la conscience et des anomalies électroencéphalographiques de nature pré ou épileptiques. L'encéphalopathie associée au sepsis (EAS) accroît significativement la mortalité et est associée à des séquelles psycho-cognitives. Il n'existe à ce jour aucun traitement spécifique préventif ou curatif de l'EAS. Sa physiopathologie, insuffisamment élucidée, résulterait de manière non-exclusive de trois processus, neuro-inflammatoire, ischémique, et métabolique qui aboutirait à un dysfonctionnement ou une mort neuronale, dont les anomalies électroencéphalographiques seraient la conséquence. Ces processus affecteraient préférentiellement les structures du système nerveux autonome et limbique, contribuant à la surmortalité et aux troubles psycho-cognitifs. La microglie interagit avec tout type de cellules cérébrales et est dotée de capacités de ramification, de migration, de phagocytose et de libération de médiateurs. Elle est impliquée dans la défense immunitaire du cerveau mais également dans l'homéostasie synaptique. Son activation est une étape déterminante du processus neuro-inflammatoire. Activée, elle peut être neuroprotectrice ou neurotoxique selon l'immuno-phénotype qu'elle aurait acquis, dépendant lui-même de son statut métabolique et variablement corrélé à sa morphologie. Ainsi la cellule microgliale serait-elle, dans l'EAS, une cible thérapeutique privilégiée. En raison de son action antiépileptique mais également anti-neuro-inflammatoire astrocytaire, nous avons fait l'hypothèse que le Levetiracetam (LEV) modulerait la réponse microgliale au cours du sepsis. Dans un modèle murin de péritonite bactérienne par ligature et ponction caecale, nous avons observé que le LEV réduisait la mortalité et la sévérité du comportement de maladie chez les souris septiques. L'intensité de l'expression microgliale des marqueurs Iba1, NOS2, HIF1a et de COX2 étaient significativement diminuées chez les souris septiques traitées par LEV, tant dans les centres neurovégétatifs, que l'amygdale, l'hippocampe et le cortex frontal. Nos observations in vitro sur les cellules microgliales BV2 murines stimulées par LPS ont mises en évidence que le LEV réduisait: 1) leur mort d'origine non-apoptotique tout en augmentant leur prolifération; 2) l'expression des gènes impliqués dans les réponses à l'hypoxie, aux cytokines et au stress ; 3) l'expression génique de nos2 et ptgs2 ; 4) la libération de NO et de PGE2, médiateurs potentiellement neurotoxiques ; 5) la glycolyse au bénéfice de la phosphorylation oxydative, optimisant ainsi la fonction mitochondriale et la production d'ATP. En revanche, nous n'avons pas constaté d'effet du LEV sur l'immuno-phénotype des cellules microgliales ni leur capacité de phagocytose. Ces effets transcriptomiques et métaboliques ne sont pas médiés par le SV2a, cible neuronale du LEV dont nous n'avons pas mis en évidence l'expression microgliale. Ces résultats in vitro et in vivo démontrent que le LEV est indépendamment du SV2a un modulateur des cellules microgliales activées par LPS dont il réduit la libération de médiateurs neurotoxiques et le dysfonctionnement mitochondrial. Cet effet, prédominant dans les centres neurovégétatifs et limbiques ainsi que l'hippocampe et le cortex frontal, contribuerait à son à réduire la mortalité et la sévérité de l'EAS à la phase aiguë d'une péritonite expérimentale. Ces résultats incitent à identifier la cible microgliale du LEV ainsi qu'à confirmer ces bénéfices chez les patients septiques.

Sepsis is defined by the association of infection and organ failure following dysregulation of the host response. The management of sepsis is a worldwide public health challenge due to its high incidence (more than 30 million patients per year) and mortality exceeding 60% when it progresses to septic shock. One of the most common organ failures is encephalopathy, characterized mainly by disorders of consciousness and electroencephalographic abnormalities, particularly pre- or epileptic. Sepsis-associated encephalopathy (SAE) significantly increases mortality and is associated with psycho-cognitive disorders. To date, there is no specific preventive or curative treatment for SAE. While SAE is not considered a direct infection of the central nervous system, its pathophysiology remains insufficiently elucidated. In a non-exclusive way, it would result from neuro-inflammatory, ischemic and metabolic processes that would result in neuronal dysfunction or death, reflected to some extent by the electroencephalographic abnormalities. These processes would preferentially affect the autonomic and limbic centers, accounting for its association with higher mortality and psycho-cognitive disorders.The microglia interacts with any type of brain cell and has the ability to ramify, migrate, phagocytize and release mediators. It is involved in the brain immune defense but also in synaptic homeostasis. Its activation is a determining step in the neuro-inflammatory process. When activated, the microglial cell can become neuroprotective or neurotoxic, according to its acquired immuno-phenotype, which is determined by its metabolic status and variably correlated to its morphology. Thus, the microglia is a relevant therapeutic target in the SAE. Because of its antiepileptic but also anti-inflammatory properties on astrocytes, we hypothesized that Levetiracetam (LEV) could modulate the microglial response during sepsis. In a mouse model of bacterial peritonitis induced by cecal ligation and puncture, we demonstrated that LEV reduced mortality and severity of sickness behavior in septic mice. The intensity of microglial Iba1, NOS2, HIF1a, and COX2 was significantly decreased in septic mice treated with LEV, in the autonomic centers but also in the amygdala, hippocampus, and frontal cortex. Our in vitro observations on LPS-stimulated BV2 murine microglial cells showed that LEV reduced: 1) their non-apoptotic death while increasing their proliferation; 2) the expression of genes involved in responses to hypoxia, cytokines, and stress; 3) gene expression of nos2 and ptgs2; 4) the release of NO and PGE2, two potentially neurotoxic mediators; 5) glycolysis to the benefit of oxidative phosphorylation, thus optimizing mitochondrial function and ATP production. In contrast, we found no effect of LEV on the immuno-phenotype of microglial cells or their phagocytic capacity. These transcriptomic and metabolic effects were not mediated by SV2a, the neural target of LEV, of which we failed to detect its microglial expression. These in vitro and in vivo results demonstrate that LEV is an SV2a-independent modulator of LPS-activated microglial cells, which reduces the release of neurotoxic mediators and mitochondrial dysfunction. This effect, predominant in neurovegetative and limbic centers as well as in the hippocampus and frontal cortex, could have contributed to reducing sepsis-related mortality and severity of SAE in the acute phase of experimental peritonitis. These results warrant identifying the microglial target of LEV and confirm whether it is beneficial for septic patients.