Etude du rôle de la protéine SlyD dans le métabolisme des métaux chez la bactérie pathogène Helicobacter pylori et chez l'organisme modèle Escherichia coli

par Milica Denic

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Hilde De Reuse.

Le président du jury était Isabelle Martin-Verstraete.

Le jury était composé de Hilde De Reuse, Isabelle Martin-Verstraete, Béatrice Py, Pierre Genevaux, Laurent Terradot, Romé Voulhoux.

Les rapporteurs étaient Béatrice Py, Pierre Genevaux.


  • Résumé

    L'acquisition et l'insertion de métaux dans les protéines sont des processus indispensables au fonctionnement de tous les organismes vivants. Chez les bactéries pathogènes, certains métaux sont essentiels au processus de virulence. Le nickel est essentiel à la survie de la bactérie Helicobacter pylori au sein de l'estomac humain. H. pylori colonise la muqueuse gastrique de la moitié de la population humaine mondiale. Cette infection est responsable de gastrites, d'ulcères et d'adénocarcinomes qui entrainent la mort de 800.000 individus chaque année. Chez H. pylori, le nickel est le cofacteur de deux enzymes indispensables à la colonisation in vivo, l'uréase et la [NiFe]-hydrogénase. H. pylori a développé des mécanismes spécifiques pour l'import et le stockage de ce métal. Au cours de ma thèse, nous avons cherché à caractériser la fonction de la protéine SlyD, un métallo-chaperon à activité peptidyl-prolyl cis/trans isomérase (PPIase) principalement caractérisé chez Escherichia coli, dont le rôle était mal défini chez H. pylori. La protéine SlyD possède un domaine N-terminal portant les fonctions PPIase et chaperon suivi d'une extension C-terminale riche en cystéines et histidines pouvant fixer in vitro des métaux divalents comme le zinc, le cuivre ou le nickel. Tout d'abord, nous avons cherché à déterminer le rôle de SlyD dans le transport du nickel chez H. pylori. Par des tests phénotypiques et une analyse biochimique, nous avons pu établir l'importance à la fois du domaine chaperon et de l'activité PPIase de SlyD dans la régulation de l'import du nickel par l'ABC transporteur NiuBDE. De plus, par la technique du double hybride bactérien, nous avons observé que la protéine SlyD interagissait spécifiquement avec la perméase NiuD de ce système et avons identifié un motif important pour cette interaction dans la protéine NiuD. Enfin, nous avons démontré que la protéine SlyD est essentielle à la colonisation du modèle murin par H. pylori probablement parce qu'elle est importante pour l'activité du transporteur à nickel, Niu. Au cours d'un criblage génétique visant à identifier des protéines de E. coli et H. pylori interagissant avec SlyD, nous avons mis en évidence des interactions de la protéine SlyD avec des protéines à centre Fer-Soufre (FeS) et des protéines de la machinerie de biogenèse des centres FeS. Chez E. coli, un défaut de l'activité de cette machinerie provoque une résistance à certains antibiotiques résultant d'une réduction de leur import. Nos résultats montrent qu'un mutant déficient en protéine SlyD est plus résistant à la gentamycine mais également à certains stress oxydatifs chez E. coli tout comme chez H. pylori. Cette étude suggère que la protéine SlyD contrôlerait l'insertion de métaux spécifiques dans ses protéines cibles et jouerait ainsi un rôle dans leur activité. En conclusion, ce travail nous a permis de révéler un rôle nouveau et original de la protéine SlyD dans le métabolisme de métaux essentiels chez H. pylori et E. coli. Nous faisons l'hypothèse que la protéine SlyD participerait à l'insertion des métaux dans différentes protéines et serait ainsi impliquée dans de nombreux processus cellulaires.

  • Titre traduit

    Study of the role of the SlyD protein in metal metabolism of the bacterial pathogen Helicobacter pylori and the model organism Escherichia coli


  • Résumé

    Metal acquisition is crucial for all cells and for the virulence of many bacterial pathogens. In particular, nickel is a virulence determinant for the human gastric pathogen Helicobacter pylori as it is the cofactor of two enzymes essential for in vivo colonization, urease and [NiFe]-hydrogenase. H. pylori colonizes the gastric mucosa of half of the human population worldwide causing the development of gastritis, peptic ulcer disease and adenocarcinoma that leads to the death of more than 800,000 individuals every year. To import nickel despite its scarcity in the human body, H. pylori possesses efficient uptake, storage and trafficking mechanisms. The objective of my PhD was to characterize the function of the SlyD metallochaperone in H. pylori. SlyD is a two-domain cytoplasmic protein, mainly studied in Escherichia coli. The N-terminal domain of the protein comprises a peptidyl-prolyl cis/trans isomerase (PPI) and a chaperone domain. The C-terminal extension is rich in histidine and cysteine residues and binds divalent metals in vitro (zinc, copper and nickel). First, we focused on the role of the SlyD protein in nickel uptake and trafficking in H. pylori. Using in vitro biochemical tests and in vivo nickel uptake assays, we established the importance of both the SlyD chaperone domain and the PPIase activity in the regulation of nickel import by the ABC-transporter, NiuBDE. Moreover, using bacterial Two Hybrid assays, we demonstrated direct interaction between the SlyD protein and the NiuD permease of this system. In addition, a motif important for this interaction was identified in the NiuD protein. We demonstrated that the SlyD protein is essential for the colonization of the mouse model by H. pylori, this is likely a consequence of its role on the activity of the Niu nickel transport system. We performed a large-scale screen to define the SlyD protein-protein interaction network in E. coli and H. pylori. We observed interactions of SlyD with iron-sulfur (FeS) proteins and proteins involved in the biosynthesis machinery of FeS clusters in both organisms. It was previously shown that, in E. coli, a defect in the activity of the FeS machinery causes resistance to some antibiotics as a consequence of their reduced import. Our results show that both E. coli and H. pylori mutants deficient in SlyD are more resistant to gentamycin and also to some oxidative stresses. This study suggests that the SlyD protein would control the proper insertion of specific metals to their target proteins and thus ensure their function. In conclusion, this work identified a new and original role of the SlyD protein in the metabolism of essential metals in H. pylori and E. coli. We hypothesize that the SlyD protein takes part in a regulatory network involved in metal insertion in proteins and might therefore be important for multiple cellular processes.

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