Caractérisation fonctionnelle et exploration du spectre phénotypique de gènes responsables de malformations cérébrales

Identification, functional characterization and phenotypic spectrum of genes responsible for neurodevelopmental anomalies

• Auteur / Autrice : Lucile Boutaud
• Direction : Tania Attié-Bitach, Sophie Thomas
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 10/12/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : David Geneviève
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christel Depienne
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : David Geneviève, Christine Laclef

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules souches pluripotentes induites

Électroporation

Organoïde cérébral

Migration neuronale

Cervelet

Corps calleux

Cortex cérébral

Malformations

Cerveau

Mots clés libres

Anomalies cérébrales

Cortex cérébral

Corps calleux

Cervelet

Organoïdes cérébraux

Electroporation in utero

Rosettes neurales

HIPSC

Génétique

CRISPR/Cas9

Migration neuronale

Cerebral anomalies

Cerebral cortex

Corpus callosum

Cerebellum

Cerebral organoids

In utero electroporation

Neural rosettes

HIPSC

Genetics

CRISPR/Cas9

Neuronal migration

Résumé

Les anomalies de développement cérébral sont à l'origine de troubles neurologiques de sévérité variable parmi lesquels les déficits cognitifs, l'épilepsie, les troubles moteurs et du comportement. Si l'avènement des techniques d'analyse globale du génome et notamment l'analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA) ou plus récemment le séquençage haut débit ont permis d'augmenter de façon exponentielle l'identification des bases moléculaires d'anomalies neuro-développementales, nombre d'entre elles demeurent inexpliquées et les mécanismes physiopathologiques sous-jacents mal compris. Mon projet de thèse s'inscrit dans le cadre de l'étude d'une cohorte multicentrique de patients et fœtus atteints de malformations cérébrales telles les malformations du cortex cérébral, les malformations du corps calleux et les hypoplasies cérébelleuses. Je me suis en particulier focalisée sur les anomalies neurodéveloppementales les plus évocatrices d'anomalies du cil primaire, un organelle nécessaire à toutes les étapes du développement cérébral, de la fermeture du tube neural, à la prolifération et à la différenciation des progéniteurs neuraux, jusqu'à la migration neuronale et à la mise en place des connexions synaptiques. Mon projet de thèse a ainsi porté sur plusieurs types d'anomalies cérébrales : 1) la microcéphalie associée à des mutations du gène RTTN codant une protéine centrosomale, travail qui nous a permis de rapporter la première description neuro-pathologique des conséquences de l'invalidation de ce gène chez l'homme, 2) les malformations du corps calleux de découverte anténatale dans le cadre d'une ciliopathie par mutations d'OFD1 ou d'une maladie métabolique avec en particulier l'identification d'un nouveau gène codant une protéine d'assemblage du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale (TIMMDC1), et 3) l'hypoplasie cérébelleuse associée ou non à une malformation du cortex cérébral et pour lesquelles nous avons identifié un nouveau gène candidat, ASTN1, impliqué dans la migration neuronale. Au-delà du séquençage haut débit, et en plus des études neurohistopathologiques et fonctionnelles que j'ai pu réaliser sur tissus de fœtus humains, j'ai choisi de profiter des avancées technologiques en biologie moléculaire et cellulaire pour développer des approches de modélisation pertinentes permettant de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l'origine de ces anomalies neurodéveloppementales. Ainsi, la reprogrammation de cellules somatiques en cellules pluripotentes induites (human Induced Pluripotent Stemcells, hIPSC) couplée à l'édition du génome (CRISPR/CAS9) m'a permis de générer des clones hIPSC mutés ainsi que leurs contrôles isogéniques. J'ai de plus pu confirmer que les modèles cellulaires 2D (rosettes neurales) et 3D (organoïdes cérébraux) de développement du cortex cérébral humain générés à partir d'hIPSC permettent de disséquer les divers mécanismes qui contrôlent le développement du cortex cérébral et en particulier la fonction du cil primaire en conditions normale et pathologique. Parallèlement, et afin de tester l'hypothèse d'un gain de fonction secondaire aux mutations d'ASTN1, j'ai choisi une approche complémentaire in vivo, par électroporation in utero d'embryons murins, permettant de modéliser la surexpression d'ASNT1 sauvage et muté afin d'en étudier les conséquences sur le développement néocortical. Dans l'ensemble, ce travail a permis l'identification de 2 nouveaux gènes dont les mutations sont responsables d'anomalies de développement cérébral, de décrire les anomalies neuro-histologiques associées à l'invalidation de 6 gènes (RTTN, OFD1, CTSD, TIMMDC1, EARS2, MRPS22) par l'étude de cas fœtaux humains. Concernant ASTN1, les approches de modélisation in vivo et in vitro que j'ai développées ouvrent des hypothèses quant aux mécanismes physiopathologiques associés aux mutations de cet excellent gène candidat.

Cerebral developmental anomalies lead to various neurodevelopmental disorders including cognitive deficiency, epilepsy, motor and behavioral disorders. If the advent of global genome analysis techniques and in particular molecular caryotyping or more recently high throughput sequencing have allowed an exponential increase in the identification of the genetic basis of neurodevelopmental abnormalities, many remain unexplained and the underlying pathophysiological mechanisms poorly understood. My phD project relies on a multicentric cohort of patients and fetuses with various neurodevelopmental anomalies such as cerebral cortical malformations, corpus callosum malformations and cerebellar hypoplasia. In particular, I focused on neurodevelopmental anomalies reminiscent of abnormal biogenesis or function of the primary cilium, an organelle required for many fundamental processes of brain development, from the closure of the neural tube up to the neuronal migration and the establishment of synaptic connections, including proliferation and fate determination of neural progenitors. My thesis project thus focused on several types of cerebral anomalies: 1) microcephaly due to mutations in RTTN, a gene encoding a centrosomal protein, allowing us to report the first neuropathological description associated to RTTN mutations in human fetal cases, 2) malformations of the corpus callosum in the context of a ciliopathy due to OFD1 mutations or of a metabolic disease with the identification of a novel gene encoding a protein required for the assembly of the mitochondrial complex I (TIMMDC1), and 3) cerebellar hypoplasia associated or not with a malformation of the cerebral cortex and for which we have identified a new candidate gene, ASTN1, involved in neuronal migration. Beyond high throughput sequencing, and in addition to the neurohistopathological and functional analysis that I was able to perform on human fetal tissues, I chose to take advantage of technological advances in molecular and cellular biology to develop relevant modeling approaches to better understand the pathophysiological mechanisms underlying these neurodevelopmental anomalies. Thus, the reprogramming of somatic cells into human Induced Pluripotent Stem Cells (hIPSC) coupled with genome editing (CRISPR/CAS9) allowed me to generate mutated hIPSC clones as well as their isogenic controls. I was also able to confirm that the 2D (neural rosettes) and 3D (cerebral organoids) hIPSC-based models of human cerebral cortical development allow to dissect the various mechanisms that control the development of the cerebral cortex and in particular the function of the primary cilium in normal and pathological conditions. In parallel, and in order to test the hypothesis of a gain of function mechanism of ASTN1 mutations, I chose a complementary in vivo approach, by in utero electroporation of murine embryos, allowing to model the overexpression of wild-type and mutated ASTN1 in order to study their consequences on neocortical development. Overall, this work allowed the identification of two new genes whose mutations are responsible for brain developmental abnormalities and to describe the neuro-histological abnormalities associated with the invalidation of 6 genes (RTTN, OFD1, CTSD, TIMMDC1, EARS2, MRPS22) by studying human fetal cases. Concerning ASTN1, the in vivo and in vitro modeling approaches that I developed open interesting hypotheses as to the pathophysiological mechanisms associated with mutations of this excellent candidate gene.