Étude du métabolisme mitochondrial au cours du développement embryonnaire humain précoce

Study of mitochondrial metabolism during the development of human preimplantation embryos

• Auteur / Autrice : Kalliopi Chatzovoulou
• Direction : Julie Steffann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 06/12/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Génétiques (Paris)
• Jury : Président / Présidente : Benoît Funalot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Agnès Rötig
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Vincent Procaccio, Véronique Duranthon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Séquençage de l'ARN

Métabolisme

Mitochondries

Mitochondriopathies

Expression génique

Embryologie humaine

ADN mitochondrial

Mots clés libres

ADN mitochondrial

CFEE

Chaîne respiratoire

Développement précoce

Embryologie

Embryon humain

Expression génique

Hétéroplasmie

Maladies mitochondriales

Métabolisme

Mitochondries

Quantité de l'ADN mitochondrial

Séquençage d'ARN

Traitement d'infertilité

Transcriptome

Transfert nucléaire

Taux de mutation

CFEE

Embryology

Heteroplasmy

Human embryo

Infertility treatment

Gene expression

Metabolism

Mitochondria

Mitochondrial disorders

Mitochondrial DNA

Mitochondrial DNA quantity

Mutant load

Mitochondrial replacement therapy

Preimplantation development

Respiratory chain

RNA-sequencing

Transcriptome

Résumé

Les mitochondries jouent un rôle important dans le développement embryonnaire humain précoce, en fournissant l'énergie nécessaire à la reprise de la méiose, à l'activation du zygote et à l'embryogenèse. Si des défauts mitochondriaux sont associés à des infertilités, certaines études ont paradoxalement montré la nécessité d'un métabolisme «calme» dans l'embryon précoce, soulignant la nécessité d'une régulation fine du métabolisme oxydatif à ce stade. Afin de déterminer si des défauts qualitatifs et/ou quantitatifs de l'ADN mitochondrial (ADNmt) ont un impact sur le développement embryonnaire humain précoce, nous avons étudié les conséquences de mutation de l'ADNmt sur les paramètres embryonnaires. Nous avons comparé la qualité et la viabilité des embryons préimplantatoires « témoins » (n=165, à risque d'être atteints d'une maladie génétique non-métabolique, non-mitochondriale) à des embryons «Mito» (n=16, issus de patientes porteuses des mutations m.8344A>G, m.3243A>G et m.9185T>C). Nous avons mesuré la quantité d'ADNmt sur une ou deux cellule(s) isolée(s) de ces embryons au troisième jour de vie (J3), afin de détecter une possible adaptation au déficit respiratoire induit par les mutations chez les embryons Mito. Nous n'avons observé aucun effet d'une mutation de l'ADNmt sur la qualité et/ou viabilité embryonnaire, ainsi que sur la quantité de l'ADNmt. De plus, les paramètres de réserve ovarienne ou l'âge maternel n'ont aucune influence sur la quantité d'ADNmt embryonnaire. Nos travaux sont en faveur d'une absence d'événement de sélection envers les mutations de l'ADNmt à ce stade très précoce du développement. Ces observations vont à l'encontre de précédents résultats de notre équipe montrant que les embryons à un stade plus tardif (J5) compensent la présence de certaines mutations (m.3243A>G) en augmentant leur quantité d'ADNmt. Afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, nous avons comparé le transcriptome d'embryons témoins (n=33) à celui d'embryons atteints d'une maladie mitochondriale (n=9), collectés au stade blastocyste (J5-7). Nous avons observé une dérégulation de l'expression génique dans les embryons atteints, avec une répression des gènes impliqués dans la phosphorylation oxydative, et une surexpression de gènes impliqués dans la survie et la mort cellulaire. Nos résultats suggèrent qu'un défaut mitochondrial a des effets délétères sur le métabolisme mitochondrial et l'homéostasie cellulaire dès le stade préimplantatoire, occasionnant la mise en place de mécanismes adaptatifs nécessaires à la survie embryonnaire. Enfin, dans le cadre d'une collaboration, nous avons étudié les effets sur le développement embryonnaire humain de la molécule cFEE, analogue du site de fixation de la protéine ADAM2 spermatique, et connue pour augmenter chez la souris les taux de fécondation d'ovocytes et le pourcentage de blastulation, et chez l'humain améliorer le développement préimplantatoire. Afin de détecter un lien entre les effets positifs de la cFEE et le métabolisme mitochondrial, nous avons comparé la quantité d'ADNmt dans des embryons témoins (n=9) et traités par cFEE (n=9), au stade blastocyste. Nous n'avons trouvé aucune différence de quantité d'ADNmt entre les embryons témoins et traités, suggérant que la cFEE agit via une autre voie. En conclusion, nous montrons que si la présence d'une mutation d'un gène mitochondrial n'a pas de répercussion notable sur le développement embryonnaire précoce en terme de qualité et viabilité, elle impacte le métabolisme mitochondrial de l'embryon dès les premiers jours, via une dérégulation de l'expression génique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes est fondamentale pour garantir la mise en place des méthodes de lutte contre l'infertilité et de prévention de la transmission des maladies par mutation de l'ADNmt dans des conditions de sécurité satisfaisantes.

Mitochondria play an important role in early human embryo development, by supplying sufficient levels of energy to sustain the reinitiation of meiosis, the zygotic activation and embryogenesis. Many studies have shown an association between mitochondrial dysfunctions and fertility impairments. Strikingly, other studies have also reported that a viable embryonic development requires a 'quiet' metabolism, emphasizing the importance of a controlled regulation of the oxidative metabolism at this stage. To elucidate if qualitative and/or quantitative defects of the mtDNA might affect human preimplantation embryo development, we first investigated if mtDNA mutations alter embryonic parameters. We compared embryonic quality and viability between 'control' embryos (n=165, at risk to carry a non-metabolic, non-mitochondrial genetic disorder) and 'Mito' embryos (n=16, issued from patients carrying the m.8344A>G, m.3243A>G and m.9185T>C mutations). We also assessed the mtDNA content in one or two embryonic cell(s), sampled at day-3 of development (D3), in order to detect any adaptation induced by mtDNA mutations in the 'Mito' group. We found that the presence of mtDNA mutations has no impact on either embryonic quality or viability and does not impair the mtDNA amount at this stage. Moreover, mtDNA amount was not modified by maternal parameters, such as maternal age or ovarian reserve. Based on these results, we concluded that selection events against mtDNA mutations do not take place at this very early stage of development. These observations contrasted with our previous results, showing at a later stage (D5) an increase of mtDNA content in embryos carrying specific mtDNA mutation (m.3243A>G). To further investigate the mechanisms in this case, we compared the transcriptome of control embryos (n=33) and mitochondrial embryos (n=9, affected by a mitochondrial disorder), collected at the blastocyst stage (D5-7). Global disruption of mitochondrial gene transcription was observed in mitochondrial embryos, with a decrease of the oxidative phosphorylation gene expression levels, as well as an upregulation of genes implicated in cell death and survival. Our results suggest that a mitochondrial defect exerts damaging effects over mitochondrial metabolism and cellular homeostasis from the preimplantation stage, and induces adaptive mechanisms necessary for embryonic survival. Lastly, in the context of a collaboration, we have studied the effects of the cFEE molecule on human embryonic development. cFEE is an analog of the sperm surface ADAM protein, and has been shown in mice to increase oocyte fecundity and blastulation rates, and in humans to improve human embryonic development. To investigate a potential link between the beneficial effects of cFEE and mitochondrial metabolism, we compared mtDNA amounts in control (n=9) and cFEE-treated (n=9) embryos, at the blastocyst stage (Day-5 and/or Day-6). We found no significant difference of mtDNA amount between the control and the treated groups, suggesting that cFEE is acting via another way. To conclude, we show that the presence of a mitochondrial defect does not affect embryonic development, in terms of embryonic quality and/or viability, although it does affect the mitochondrial metabolism of human embryos very early in the development, by disrupting gene expression. A better knowledge of these mechanisms is fundamental to assess the safety of procedures aiming to treat infertility or to prevent mtDNA disorder transmission.