Hétérogénéité des réponses immunes post-septiques : approche translationnelle

Heterogeneity of post-septic immune responses : a translational approach

• Auteur / Autrice : Jean-François Llitjos
• Direction : Frédéric Pene
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance le 24/06/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Cochin (Paris ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : Antoine Guillon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Antoine Guillon, Fabienne Venet, Antoine Roquilly, Nicolas de Prost, Florence Niedergang
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Fabienne Venet, Antoine Roquilly

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteur de type Toll-2

Macrophages alvéolaires

Macrophages

Monocytes

Récepteurs de type Toll

Lymphocytes T régulateurs

Réponse immunitaire

Choc septique

Mots clés libres

Choc septique

Hétérogénéité

Macrophage alvéolaire

T régulateurs

TLR2

Monocytes

Septic shock

Heterogenity

Alveolar macrophage

Regulatory T cells

TLR2

Monocytes

Résumé

Le sepsis consécutif à l'infection microbienne est une entité clinique complexe, caractérisée par la survenue simultanée d'une dysrégulation de la réaction inflammatoire initiale et d'une immunodépression associant des anomalies quantitatives et fonctionnelles des cellules de l'immunité innée et de l'immunité adaptative. La plupart des dysfonctions immunitaires induites par le sepsis ont été associées à une susceptibilité accrue aux infections nosocomiales, au premier rang desquelles les pneumonies acquises sous ventilation mécanique (PAVM). Toutefois, il semble exister une variabilité dans la susceptibilité à ces infections acquises en réanimation. Dans un premier temps, nous avons identifié chez les patients pris en charge pour un choc septique un risque accru de PAVM dans les suites d'une première agression pulmonaire en comparaison des autres sites infectieux. Par ailleurs, dans le contexte pandémique, nous avons identifié que la COVID-19 était indépendamment associée à un risque accru de pneumonie nosocomiale, suggérant ainsi que l'infection à SARS-CoV-2 induit des altérations particulières de l'immunité pulmonaire. A l'aide de deux modèles murins d'infection pulmonaire (pneumonie à E. coli) et extra-pulmonaire (ligature ponction caecale, LPC) et de leurs contrôles respectifs (laparotomie simple et instillation de PBS), tous suivis d'une seconde pneumonie à Pseudomonas aeruginosa après 7 jours, nous avons pu mettre en évidence une différence de susceptibilité et de clairance bactérienne dans les suites d'une pneumonie secondaire à P.aeruginosa en fonction du site infectieux initial, ainsi que des modifications quantitatives et fonctionnelles des cellules immunitaires pulmonaires. En comparaison des souris ayant subi une laparotomie simple, les souris post-LPC ont une susceptibilité accrue à une pneumonie secondaire à P. aeruginosa avec une diminution de la clairance bactérienne et une mortalité plus importante (50% versus 0%, p<0.05). A l'inverse, l'ensemble des souris ayant eu une pneumonie à E. coli a survécu à cette seconde pneumonie, avec une augmentation de la clairance bactérienne. L'évaluation de la composition cellulaire pulmonaire au 7ème jour (avant la seconde pneumonie) a montré une diminution du nombre de macrophages alvéolaires (MA) chez les souris post-LPC et une augmentation chez les souris post-pneumonie. A l'inverse des MA post-LPC, les MA de souris post-pneumonie expriment fortement le CMH de classe II, ont une signature transcriptomique orientée vers les défenses antibactériennes et stimulent la prolifération antigène-spécifique de lymphocytes T CD4. De plus, nous avons identifié une augmentation de la proportion des lymphocytes T CD4 régulateurs (Tregs) dans les poumons de souris post-LPC en comparaison des autres conditions, cette augmentation étant dépendante de la voie de signalisation du TLR2. La déplétion des Tregs préalablement à la survenue de la seconde pneumonie à P. aeruginosa par des anticorps bloquants dirigés contre le CD25 restaure la survie et la clairance bactérienne chez les souris post-LPC. Leur déplétion est aussi associée à une restauration du nombre et des fonctions des MA post-LPC. Compte-tenu des difficultés d'accès aux macrophages tissulaire en pratique clinique, nous avons évalué les fonctions des monocytes circulants à l'aide d'une technique expérimentale innovante basée sur l'encapsulation de cellules dans des gouttelettes lipidiques dans un système de microfluidique. Nous avons évalué en temps réel la sécrétion individuelle de TNFα par des monocytes de patients septiques (n=7) et de volontaires sains (n=10) exposés à une stimulation par LPS. En confrontant les résultats à ceux obtenus par cytométrie de flux (expressions membranaire de HLA-DR et intracellulaire de TNFα), nous avons pu mettre en évidence l'existence d'une variabilité temporelle importante et d'une grande hétérogénéité des réponses monocytaires chez les patients septiques.

Sepsis following microbial infection is a complex clinical entity, characterized by the simultaneous occurrence of an initial dysregulated inflammatory response and protracted immune suppression associating quantitative and functional abnormalities of immune cells. Most of the immune dysfunction induced by sepsis has been associated with an increased susceptibility to nosocomial infections, first and foremost ventilator-acquired pneumonia (VAP). However, there appears to be variability in the susceptibility to these ICU-acquired infections. First, we identified in patients admitted in the intensive care unit for septic shock an increased risk of VAP after a first pulmonary infection when compared to other sites of infection. Furthermore, in the pandemic context, we have identified that COVID-19 was independently associated with an increased risk of nosocomial pneumonia, thus suggesting that SARS-CoV-2 infection induces particular lung immune. Using two murine models, we then addressed the impact of primary pulmonary and non-pulmonary infectious insults on lung immunity. Mice were first subjected either to polymicrobial peritonitis induced by caecal ligation and puncture (CLP), or to bacterial pneumonia induced by intra-tracheal (i.t.) instillation of Escherichia coli. Respective control mice were subjected to sham surgery or intra-tracheal instillation of phosphate-buffered saline. Seven days later, mice that survived the primary insult were subjected to i.t. instillation of Pseudomonas aeruginosa (PAO1 strain). We assessed survival and pulmonary bacterial clearance of after P. aeruginosa pneumonia, as well as quantitative and functional changes in lung immune cells. When compared to sham-operated mice, post-CLP animals exhibited increased susceptibility to secondary P. aeruginosa pneumonia as demonstrated by defective lung bacterial clearance and increased mortality rate (50% vs. 0%, p< 0.05). In contrast, all post-pneumonia mice survived and even exhibited improved bacterial clearance as compared to their control counterparts. When addressing whole-lung immune cell distribution prior to second hit (day 7), amounts of alveolar macrophages (AM) were decreased in post-CLP mice while increased in post-pneumonia mice. In contrast to post-CLP, AM from post-pneumonia mice express high MHC-II, a defence-ready transcriptomic signature and promotes antigen-specific CD4 T cells proliferation. Additionally, we observed a TLR2-dependent increase in regulatory T cells (Tregs) proportion among CD4 T cells in the lung of post-CLP mice at day 7 when compared to controls and post-pneumonia mice. CD25-mediated depletion of Tregs prior to P. aeruginosa pneumonia restored survival and bacterial clearance in post-CLP mice. Tregs depletion was associated with restoration of numbers and functions of AMin post-CLP mice. Given the difficulties in accessing tissue macrophages in clinical practice, we evaluated the functions of circulating monocytes using an innovative experimental technique based on the encapsulation of cells in lipid droplets in a microfluidic system. We evaluated in real time the individual secretion of TNFα by monocytes from septic patients (n = 7) and healthy volunteers (n = 10) exposed to stimulation by LPS. By comparing the results with those obtained by flow cytometry (membrane expressions of HLA-DR and intracellular expressions of TNFα), we were able to demonstrate the existence of a significant temporal variability and a great heterogeneity of the monocytic responses in septic patients.