À la rencontre des ''readers'' de l'ADN méthylé

Meet the readers of DNA methylation

• Auteur / Autrice : Diane Erdmann
• Direction : Paola Barbara Arimondo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interface chimie-biologie
• Date : Soutenance le 10/12/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité Chimie biologique épigénétique
• Partenaire(s) de recherche : Structure de recherche : Institut Pasteur. Département de Biologie structurale et chimie (2006-….)
• Jury : Président / Présidente : Laurent Micouin
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre-Antoine Defossez, Marie Lopez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Daniela Verga, Arnaud Gautier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance magnétique nucléaire

Ligands

Méthylation

ADN

Épigénétique

Mots clés libres

Epigénétique

Méthylation de l'ADN

MBD2

Ligands

Essais biophysiques de criblage

RMN

Epigenetics

DNA methylation

MBD2

Ligands

Biophysical screening assays

RMN

Résumé

L'épigénétique s'est beaucoup développée lors des dernières décennies. Les marques épigénétiques les plus étudiées chez les mammifères sont les modifications d'histones et la méthylation de l'ADN, cependant leurs implications dans la régulation de l'expression des gènes n'est pas complètement élucidée. La mise en évidence des mécanismes de dérégulation épigénétique dans les maladies a conduit à des thérapies ciblant spécifiquement ces modifications. La majorité des cibles thérapeutiques sont des « writers » ou « erasers » de la modification épigénétique impliquée dans la pathologie. Cependant les mécanismes des protéines qui reconnaissent ces modifications épigénétiques sont encore peu connus. Les protéines de reconnaissance de l'acétylation des lysines, les bromodomaines avec un domaine extra terminale (BET-BRD) font partis du peu de familles de « readers » épigénétiques ciblés dans les thérapies. Deux molécules sont actuellement en développement. Concernant la méthylation de l'ADN, il n'est encore compris comment elle est lue et traduite dans la fonction de la chromatine et la réponse cellulaire. Pour combler cette zone d'ombre, nous avons mis en place une stratégie pour cibler les « methyl-CpG readers », spécifiquement les protéines Methyl-CpG Binding Domain (MBDs). Pour mettre en place des essais biochimiques et biophysiques d'interaction protéine-composé, MBD2 a été choisi car il a la plus grande affinité pour l`ADN méthylé et a été identifié comme un gène non vital. Nous avons conçu des analogues de la 5-méthylcytosine et des structures d'acides nucléiques peptidiques (PNA) avec des bases modifiées, pour constituer une chimiothèque synthétisée au laboratoire. Grâce à l'essai de « protein thermal shift », à la technique de thermophorèse microscopique (MST) et à la technologie d'AlphaScreen®, nous avons identifié des fragments qui interagissent avec MBD2 humaine et interfèrent avec le complexe constitué de MBD2 et de l'ADN méthylé. Ces essais nous ont également permis d'évaluer l'affinité MBD2-molécule. La RMN 2D (1H 15N) et le docking virtuel nous ont donné un point de vue structural sur les interactions, nous permettant de guider l'optimisation chimique. Les premiers résultats mettent en évidence des groupements importants pour l'interaction avec MBD2. Ces informations offrent un bon point de départ pour obtenir les premières sondes interagissant sélectivement avec MBD2 et déplaçant son interaction avec l'ADN méthylé.

Epigenetics has received a lot of attention in the last decade. Histone modifications and DNA methylation are the epigenetic marks the most studied but their implications in gene expression regulation are not completely understood in mammals. Many insights on epigenetic (dys)regulation in diseases have been obtained and clinical therapies targeting epigenetic dysregulations are in place. The majority of the targets of these therapies are writers or erasers of the epigenetic modification involved. However, the process of reading of the epigenetic marks are lacking behind this revolution. The extra terminal bromodomains (BET-BRD, recognition of acetylated lysine) are one of the few epigenetic readers targeted for therapy. Two promising molecules are currently in development. Regarding DNA methylation, it is poorly understood how this modification is being read and translated to chromatin function and cellular responses. To study this mechanism, we are developing a chemical strategy to target the methyl-CpG readers (MBPs), in particular the family of the Methyl-CpG Binding Domain proteins (MBD). Considering its high affinity for methylated DNA and its identification as a non-vital gene, MBD2 was chosen as the MBD member to be targeted through in vitro biochemical and biophysical assays. We have designed analogues of 5-methylcytosine and peptides nucleic acid (PNA) with modified bases, constituting an in-house chemical library to target MBD2. Using protein thermal shift, Microscale Thermophoresis (MST) and AlphaScreen® assays, we were able to identify fragments that interact with human MBD2 and interfere with its binding to methylated DNA. In addition, we were able to evaluate the affinity MBD2-compound. 2D NMR (1H, 15N) and virtual docking gave structural insights on the interaction that allow to improve the compounds and guide the chemical modulation. The first results highlight few chemical groups important for the interaction with MBD2. This information is a good starting point for the development of the first selective chemical probes for human MBD2.