Biosynthèse des nucléotides puriques chez les bactéries : identification d'un métabolon et exploration de la régulation allostérique d'une enzyme-clé de la voie de novo, l'inosine 5'-monophosphate déshydrogénase

Biosynthesis of purine nucleotides in bacteria : identification of a metabolon and exploration of the allosteric regulation of inosine 5'-monophosphate dehydrogenase, a key enzyme in the de novo pathway

• Auteur / Autrice : Antoine Gedeon
• Direction : Hélène Munier-Lehmann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 17/12/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Groupe Biochimie et chémobiologie
• Partenaire(s) de recherche : Partenaire de recherche : Institut Pasteur (Paris ; 1887-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Martin-Verstraete
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Étienne Blanc, Marc Feuilloley
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Philippe Minard, Sandrine Boschi-Muller

Mots clés

Mots clés contrôlés

Escherichia coli

Enzymologie

Protéines

Allostérie

Inosine monophosphate déshydrogénase

Synthèse (chimie)

Purines

Mots clés libres

Biosynthèse des purines

Métabolon

Bactérie

Inosine 5'-monophosphate déshydrogénase

Domaine Bateman

Allostérie

Biologie structurale

Biochimie

Ingénierie des protéines

Enzymologie

Biophysique

Génétique

Purine biosynthesis

Metabolon

Bacteria

Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase

Bateman domain

Allostery

Structural biology

Biochemistry

Protein engineering

Enzymology

Biophysics

Genetics

Résumé

La biosynthèse des nucléotides puriques, regroupant la voie de sauvetage et la voie de novo, est essentielle chez tous les organismes vivants. Plusieurs modes de régulation coexistent pour assurer le maintien des concentrations physiologiques en nucléotides. Dans le cadre de ma thèse, deux niveaux de régulation de cette voie chez E. coli ont été étudiés. Premièrement, en utilisant une technique de double hybride bactérien (BACTH), les interactions binaires protéine-protéine des 14 enzymes de la voie de novo chez E. coli ont été cartographiées, mettant en évidence l'existence d'un assemblage supramoléculaire de ces enzymes. L'organisation de ce complexe apparaît différente de celle de son homologue eucaryote connu sous le nom de purinosome, avec notamment PurK, le hub du complexe chez E. coli et sans équivalent chez les eucaryotes. De plus un mutant d'E. coli du gène purK dont certaines des interactions protéine-protéine sont altérées a été créé et des tests de compétition entre les souches sauvage et mutante indiquent un avantage de fitness de la souche sauvage par rapport à la souche mutante, suggérant un rôle physiologique de la formation du complexe. Le deuxième volet de la thèse portait sur la compréhension de la régulation allostérique d'une enzyme-clé de la voie, l'inosine 5'-monophosphate déshydrogénase (IMPDH). Cette enzyme, catalysant la conversion dépendante du NAD de l'IMP en XMP, est formée de deux domaines structuraux, le domaine catalytique (DC) et le domaine Bateman (DB). Les études précédentes du laboratoire sur différentes IMPDHs bactériennes avaient conduit à la définition de deux classes d'IMPDHs, qui présentent des différences cinétiques et oligomériques suite à la fixation du MgATP sur le domaine Bateman. Pour mieux comprendre le rôle du domaine Bateman à l'échelle moléculaire, différents variants ont été caractérisés par des études biochimiques, biophysiques et structurales : des variants dont le domaine Bateman a été supprimé, et des protéines chimères issues de l'échange du domaine Bateman d'une classe par celui de l'autre classe. Tous les variants générés sont catalytiquement actifs. Plus surprenant encore, le transfert du domaine Bateman d'une classe I (IMPDH de P. aeruginosa, IMPDHpa) dans les domaines catalytiques d'une classe II (IMPDH de B. thailandensis, IMPDHbt et IMPDH d'E. coli, IMPDHec) conduit à un fort impact sur les propriétés catalytiques : les deux chimères (DCec DBpa et DCbt DBpa) sont activées par le MgATP, et leurs paramètres catalytiques sont similaires à ceux de l'enzyme sauvage, dont le domaine Bateman est dérivé, i.e. l'IMPDHpa. Il en est de même pour la troisième chimère (DCpa DBec), où le domaine Bateman d'une classe II (IMPDHec) a été inséré dans le domaine catalytique d'une classe I (IMPDHpa). Pour cette chimère, les paramètres cinétiques restent inchangés en présence de MgATP, mais l'état oligomérique est modifié vers une espèce octamérique. Enfin, des tests de compétition bactériennes d'une souche délétée du gène codant l'IMPDH et complémentée par différentes constructions thermosensibles codant les formes mutantes des IMPDHs sont en faveur d'un rôle physiologique du domaine Bateman.

Purine nucleotide biosynthesis, regrouping the salvation pathway and the de novo pathway, is essential in all living organisms. Several modes of regulation coexist to ensure the maintenance of physiological nucleotide concentrations. As part of my thesis, two levels of regulation of this pathway in E. coli were studied. Using a bacterial two hybrid system (BACTH), the binary protein-protein interactions of the 14 enzymes of the de novo pathway in E. coli were mapped. The results demonstrated the existence of a supramolecular assembly of these enzymes. The architecture of this complex seemed to be different from that of its eukaryotic counterpart, known as ''purinosome''. PurK, a bacterial enzyme with no equivalent in eukaryotes, was identified as the hub of the complex. Additionally, an E. coli strain hindering mutations in the purK gene and presenting alterations in some of the protein-protein interactions was created. Competition assays between the wild-type and mutant strains indicate a fitness advantage of the wild-type strain, suggesting a physiological role of the complex. The second part of the thesis focused on understanding the allosteric regulation of a key enzyme of the pathway, namely inosine 5'-monophosphate dehydrogenase (IMPDH). This enzyme catalyzes the NAD-dependent conversion of IMP to XMP. It is formed of two structural domains, the catalytic domain (CD) and the Bateman domain (BD). Previous studies on different bacterial IMPDHs had led to the definition of two classes of IMPDHs differing in kinetic and oligomeric properties after the binding of MgATP to the Bateman domain. For a better understanding of the role of the Bateman domain at the molecular level, different variants have been characterized by biochemical, biophysical and structural studies: variants which Bateman domain was deleted from, and chimeric proteins resulting from the exchange of the Bateman domain from one class to the catalytic domain of another class. All variants were found to be catalytically active. Even more surprisingly, the transfer of the Bateman domain from a class I (IMPDH of P. aeruginosa, IMPDHpa) into the catalytic domains of a class II (IMPDH of B. thailandensis, IMPDHbt and IMPDH of E. coli, IMPDHec) leads to a strong impact on the catalytic properties: the two chimeras (CDec BDpa and CDbt BDpa) are activated by MgATP, and their catalytic parameters are similar to those of the wild-type enzyme, which Bateman domain is derived from, i.e. IMPDHpa. The same was also noted for the third chimera (CDpa BDec), where the Bateman domain of a class II (IMPDHec) has been inserted into the catalytic domain of a class I (IMPDHpa). For this chimera (DCpa DBec), the kinetic parameters remain unchanged in the presence of MgATP, but the oligomeric state is modulated by MgATP, causing a shift towards an octameric species. Finally, bacterial competition tests of a strain deleted of the gene encoding IMPDH and complemented by thermosensitive constructs encoding the different IMPDH mutants are in favor of a physiological role for the Bateman domain.