Optimisation des modèles humains de barrière hémato-encéphalique par le shear stress : exemple des cellules hCMEC/D3

Improvement of human blood-brain barrier models with shear stress : example of hCMEC/D3 cells

• Auteur / Autrice : Nina Choublier
• Direction : Xavier Declèves
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 10/11/2021
• Etablissement(s) : Université Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Optimisation thérapeutique en neuropharmacologie (Paris ; 2014-....)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Olivier Couraud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Bourdoulous, Adrien Roux, Amélie Moreau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Guylène Page, Jean-François Ghersi-Egea

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cerveau -- Vaisseaux sanguins

Cellules endothéliales

Barrière hématoencéphalique

Mots clés libres

Barrière hémato-encéphalique

Cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux

Modèles in vitro

Contrainte de cisaillement

BHE sur puce

Blood-brain barrier

Brain microvascular endothelial cells

In vitro models

Shear stress

BBB-On-Chip

Résumé

Les modèles de barrière hémato-encéphalique (BHE) in vitro sont de précieux outils pour étudier les échanges entre le sang et le cerveau. Ces modèles sont principalement constitués de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC), qui détiennent les propriétés physiques et métaboliques de la BHE. Le modèle de référence de BMEC humaines est la lignée de cellules hCMEC/D3, mais leur perméabilité est altérée en raison de l'expression insuffisante de certains transporteurs et jonctions. Le shear stress (SS) est une force de cisaillement exercée par l'écoulement du sang sur la surface des BMEC, qui améliore la différenciation des cellules endothéliales. Nous supposons qu'elle pourrait optimiser les caractéristiques de barrière des BMEC en culture en restaurant l'expression de protéines spécifiques de la BHE. Ce travail a consisté à évaluer l'impact du SS sur les cellules hCMEC/D3. Une étude protéomique globale a montré que l'exposition à un SS physiologique induit l'activation des voies antioxydantes et anti-inflammatoires. Le SS participerait donc à la quiescence et l'homéostasie des cellules hCMEC/D3. En revanche, il n'a pas permis d'augmenter l'expression de protéines jonctionnelles, ni leur localisation membranaire. De même, l'activité et l'expression de transporteurs d'efflux n'était pas induite par le flux. Nous avons ensuite cultivé les cellules hCMEC/D3 à l'interface entre deux compartiments, en supposant que cette architecture plus fidèle à la BHE pourrait favoriser la réponse des cellules au SS. Un dispositif de flux a été spécialement conçu pour la culture de BMEC sous un SS homogène et laminaire, ainsi que pour l'étude des propriétés spécifiques de la BHE. Nos résultats suggèrent que le SS limiterait la perméabilité paracellulaire des cellules hCMEC/D3. Enfin, le SS a conduit à un réarrangement du cytosquelette et de la membrane plasmique. De manière surprenante, les cellules exposées au SS s'orientent différemment selon le dispositif dans lequel elles sont cultivées. Alors qu'elles adoptent une orientation perpendiculaire au flux dans un canal unique, elles s'alignent dans le sens de l'écoulement lorsqu'elles sont cultivées sur une membrane semi-perméable séparant deux compartiments. L'ensemble de ces données confirme les capacités de mécano-transduction des cellules hCMEC/D3. Le SS améliore leur physiologie globale mais ne favorise pas l'expression de protéines clés de la BHE. D'autres éléments du microenvironnement semblent nécessaires pour optimiser les caractéristiques de barrière, comme le support sur lequel les cellules reposent. Ces résultats soulignent la complexité de la réponse des BMEC au SS. Jusqu'à présent, une grande disparité de résultats est observée dans les publications en raison de méthodes de culture très variées. Nous proposons plusieurs éléments de considération qui pourraient accélérer la compréhension de la réponse des BMEC au SS.

In vitro blood-brain barrier (BBB) models are important for studying the exchanges between the blood and the brain. The particularity of the BBB brings unique properties to endothelial cells in terms of structure and functions. In vitro models are primarily composed of brain microvascular endothelial cells (BMEC), which ensure both protective sealing and selective transport at the BBB. Immortalized hCMEC/D3 cells represent the most widely used human BMEC cell line, but exhibit low tightness due to the lack of expression of some transporters and junctions. Endothelial cells are constantly submitted to hemodynamical forces derived from the blood circulation, including shear stress. This tangential force exerted on cell surface improves endothelial differentiation, suggesting that SS could optimize the BBB characteristics through upregulating some key proteins in BMEC cultures. In this work, we evaluate the response to SS in hCMEC/D3 cells. A global proteomic study showed that SS exposure induced activation of both antioxidant and anti-inflammatory pathways, suggesting that SS positively affected quiescence and homeostasis in hCMEC/D3 cells. However, SS did not increase expression levels of junctional proteins none their pericellular localisation. Similarly, both expression and activity of efflux transporters were not induced by SS. Then, hCMEC/D3 cells were cultured at the interface between two compartments. We hypothesized that this more physiologically-relevant organization could improve the BMEC response to flow. We designed and produced a new fluidic device for cultivating cells under laminar and homogenous SS, but also to investigate specific BBB properties. Our results demonstrate that paracellular permeability of hCMEC/D3 cells was reduced after SS exposure. SS initiated a reorganization at both cytoskeletal and membrane levels. Surprisingly, hCMEC/D3 cells exposed to SS exhibited a different orientation according to the device configuration. Actually, cells align them perpendicularly to the flow axis when they are cultured in a single channel fluidic device, whereas they orientate in the flow direction when they are seeded on a semi-permeable membrane separating two compartments. Taken together, these data confirm the mechano-transduction properties of hCMEC/D3 cells. Cells exposed to SS resulted in a more physiologically-relevant phenotype. However, SS did not increase levels of key proteins and transporters at the BBB. Other elements from the cellular microenvironment seems to interfere with the cell response to flow, including the material in which cells are cultured. These results highlighted the complexity of the SS response in BMEC. Until now, the literature does not allow to clearly attest to a BMEC differentiation under SS. We suggest several elements to take into consideration to better understand the BMEC response to SS.