Isolement, identification et caractérisation fonctionnelle de nouveaux microorganismes d’intérêt pour la nutrition et la santé intestinale : cas d’étude sur les bactéries fibrolytiques du cheval

Isolation, identification and functional characterization of new microorganisms of interest in nutrition and gut health : case studies on equine fibrolytic bacteria

• Auteur / Autrice : Alicia Froidurot
• Direction : Véronique Julliand
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie des populations et écologie
• Date : Soutenance le 09/12/2021
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Procédés Alimentaires et Microbiologiques (PAM) (Dijon)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation : Université de Bourgogne (1970-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphane Delaunay
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Annick Bernalier-Donadille, Hélène Licandro
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Stéphane Delaunay, Annick Bernalier-Donadille

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactéries

Acides gras

Probiotiques

Cheval -- Maladies

Foin

Flore intestinale

Mots clés libres

Bactéries cellulolytiques

Eos

F. succinogenes

R. flavefaciens

Microbiote intestinal

Probiotiques

Cellulolytic bacteria

Eos

F. succinogenes

R. flavefaciens

Intestinal microbiota

Probiotics

Résumé

Malgré leur faible quantité, les bactéries cellulolytiques jouent un rôle très important dans l’équilibre du microbiote intestinal et donc dans la nutrition et la santé du cheval par la valorisation des fibres issues des fourrages. Certains facteurs de conduite sont responsables de la diminution du nombre de bactéries cellulolytiques, conduisant à des déséquilibres du microbiote et à l’apparition de maladies intestinales. La possibilité d’utiliser les bactéries cellulolytiques comme probiotiques de nouvelle génération a été investiguée afin de les réintroduire dans le microbiote intestinal lors d’un déséquilibre. Les objectifs de ce travail de thèse étaient d’isoler de nouvelles souches cellulolytiques équines, de caractériser leurs fonctionnalités et d’évaluer leur production et conservation à grande échelle. Deux nouvelles souches ont été isolées, Fibrobacter succinogenes HC4 et Ruminococcus flavefaciens VN. Elles sont extrêmement sensibles à l’oxygène (EOS pour « extremely oxygen sensitive »). La recherche des gènes codant pour les CAZymes impliquées dans la fibrolyse et la quantification de cette activité par dosage enzymatique ont été investiguées. Les nouvelles souches ont montré de grandes capacités cellulolytique et xylanolytique. F. succinogenes HC4 est une bactérie spécialisée dans la dégradation de la cellulose alors que R. flavefaciens VN a des fonctions plus diversifiées avec notamment une activité xylanolytique très importante. L’activité fibrolytique de F. succinogenes HC4 a été étudiée in vitro dans l’écosystème fécal de chevaux préalablement soumis à un stress alimentaire induisant un déséquilibre du microbiote. L’ajout de F. succinogenes HC4 a été associé à une augmentation significative de la production en gaz et des concentrations en acides gras volatils au cours des 48 premières heures de mise en culture, en cohérence avec la diminution plus rapide de la matière sèche résiduelle du foin. Afin de produire la souche H C4 en plus grande quantité, la croissance de F. succinogenes HC4 a été obtenue dans un bioréacteur 0,5 L en condition d’anaérobiose avec de la cellulose (papier filtre Whatman No. 1) comme seule source de carbone dans un premier essai. La conservation de la souche HC4 par lyophilisation a été testée. La souche a repris sa croissance, néanmoins, une perte de deux logarithmes décimaux de bactéries viables a été observée. La composition du milieu, les conditions de croissance et les paramètres à réguler dans le bioréacteur, ainsi que l’optimisation du procédé de lyophilisation sont nécessaires afin d’augmenter sa biomasse et sa survie lors du procédé de séchage pour des durées plus longues de conservation. Ensuite le potentiel probiotique de la souche HC4 pourrait être validé par des essais in vivo.

Despite their low quantity, cellulolytic bacteria play an essential role in the balance of the intestinal microbiota and consequently in the nutrition and health of the horse as they use forage fibers. Some management factors are responsible for the decrease in the number of cellulolytic bacteria, leading to microbiota unbalances and occurrence of intestinal diseases. The possibility of using cellulolytic bacteria as new generation probiotics has been investigated to reintroduce them into the intestinal microbiota during an imbalance. The objectives of this PhD work were to isolate new equine cellulolytic strains, to characterize their functions and to evaluate their production and conservation on a large scale. Two new strains were isolated, Fibrobacter succinogenes HC4 and Ruminococcus flavefaciens VN. These two strains are extremely sensitive to oxygen (EOS). To estimate the fibrolytic activity of these strains, the search for genes coding for CAZymes involved in fibrolysis and the quantification of this activity by enzymatic assay were investigated. The new strains showed high cellulolytic and xylanolytic activities. F. succinogenes HC4 specialized in cellulose degradation while R. flavefaciens VN has more diversified functions, notably a very important xylanolytic activity. Fibrolytic activity of F. succinogenes HC4 was studied in vitro using fecal ecosystem of horses previously subjected to dietary stress inducing dysbiosis. The addition of F. succinogenes HC4 was associated with a significant increase in gas production and volatile fatty acid concentrations during the first 48 hours of culture, consistently with the rapid decrease of hay residual dry matter. For producing strain HC4 at larger scale, the growth of F. succinogenes HC4 was obtained in a 0.5 L bioreactor under anaerobic conditions with filter-paper cellulose as sole carbon source in a first trial. The preservation of strain HC4 was tested using freeze-drying. Despite a growth recovery, a loss of two log decimal of viable bacteria was observed following freeze drying. The medium composition, the growth conditions, and the regulating parameters in the bioreactor, as well as the optimization of the freeze-drying process are necessary to increase its survival during the drying process for longer storage times. Then, the probiotic potential of strain HC4 should be confirmed by in vivo trials.