Optimisation de l’expression de gènes à des fins biotechnologiques chez pseudomonas aeruginosa

Optimization of gene expression for biotechnological purposes in pseudomonas aeruginosa

• Auteur / Autrice : Mélanie Grosjean
• Direction : Patrick Plésiat, Cédric Muller
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie moléculaire
• Date : Soutenance le 08/03/2021
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire chrono-environnement (Besançon)
• Partenaire(s) de recherche : Site de Préparation : Université de Franche-Comté (1971-....)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Bleves
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Patrick Plésiat, Cédric Muller, Sophie Bleves, Jan Roelof Van der Meer, Audrey Le Gouëllec, Michael Mourez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Bleves, Jan Roelof Van der Meer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Production

Infections nosocomiales

Protéines recombinées

Virulence (microbiologie)

Résistance aux antibiotiques

Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

Pseudomonas aeruginosa

Antibiorésistance

Virulence

Bioproduction

Protéines recombinantes

Antibiotic resistance

Recombinant proteins

Résumé

Pseudomonas aeruginosa est un bacille à Gram négatif, pathogène opportuniste majeur de l’Homme, responsable d’infections nosocomiales dont la mortalité et la morbidité sont accrues pour les patients immunodéprimés. Son pouvoir pathogène repose sur la production d’un arsenal de facteurs de virulence, structuraux ou solubles. P. aeruginosa est également capable de produire de nombreux mécanismes de résistance aux antibiotiques, qui ont permis son implantation dans le domaine hospitalier. L’objectif étant de proposer une alternative à l’utilisation d’E. coli, l’actuel hôte de référence en biotechnologies, il ne peut pas être utilisé à des fins biotechnologiques comme tel. Nous avons donc entrepris de déléter du génome de la souche de référence PAO1, les principaux gènes associés à la pathogénicité et les mécanismes d’antibiorésistance. Le mutant SM54 ainsi obtenu, délesté de 37 de ses gènes soit 0,8 % du génome, a été caractérisé. Il est devenu hypersensible aux antibiotiques, 53 % moins cytotoxique (résultats in vitro) et la mortalité des sujets infectés avec SM54 est diminuée par rapport à PAO1 (résultats in vivo). Ce nouveau châssis SM54 a ensuite été utilisé comme plateforme pour évaluer la production de protéines recombinantes. Nous avons élaboré divers plasmides d’expression portant les systèmes inductibles XylS/Pm et cmrA/Pcin, et les gènes rapporteurs luxCDABE et blaAmpC. La détermination de la sensibilité aux antibiotiques a permis de mettre en évidence la production cette protéine homologue AmpC en présence des inducteurs respectifs des systèmes. Avec les outils construits, nous avons par la suite pu détecter par Western-blot la production de la cytokine humaine IL-1β chez P. aeruginosa, prouvant ainsi l’intérêt R&D du bacille pyocyanique pour la bioproduction de protéines recombinantes.

: Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative Human opportunistic pathogen, responsible for nosocomial infections with high mortality for immunocompromised patients. The pathogenesis is based on the production of many structural or secreted virulence factors. P. aeruginosa is also able to produce several resistance mechanisms to antibiotics, which allows its establishment in hospitals. The objective is to propose an alternative to E. coli, the current reference host in biotechnology, but P. aeruginosa cannot be used for biotechnological purposes as such. We therefore undertook to remove from the genome of reference strain PAO1, the main genes associated with virulence and antibioresistance mechanisms. Thus, the mutant SM54 obtained, relieved of 37 genes, i.e. 0.8% of the genome, was characterized. Its became hypersusceptible to antibiotics, 53% less cytotoxic (in vitro results) and the mortality of individuals infected with SM54 is decreased in comparison with PAO1 (in vivo results). Then, this new chassis was used as platform to evaluate the recombinant protein production. We developed various expression plasmids carrying the inducible systems XylS/Pm and cmrA/Pcin, and the reporter genes luxCDABE and blaAmpC. The antibiotic susceptibility was determined and demonstrated the production of this homologous protein AmpC, in presence of the respective inducers of systems. With these vectors, we were subsequently able to detect by Western-blot the production of human cytokine IL-1β in P. aeruginosa, thus proving the R&D interest of pyocyanic bacillus for the bioproduction of recombinant proteins.