Détermination des performances de la plateforme NanoBioAnalytique pour la détection et la caractérisation de vésicules extracellulaires : exploration de lysats plaquettaires humain à visée neuroprotectrice

Establishing the performances of the NanoBioAnalytical platform for extracellular vesicles detection and characterization : Exploration of neuroprotective human platelet lysates

• Auteur / Autrice : Balasubramaniam Namasivayam
• Direction : Wilfrid Boireau, Thierry Burnouf, Céline Caille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences pour l'Ingénieur
• Date : Soutenance le 23/07/2021
• Etablissement(s) : Bourgogne Franche-Comté
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur et microtechniques (Besançon ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : FEMTO-ST : Franche-Comté Electronique Mécanique Thermique et Optique - Sciences et Technologies (Besançon) - Franche-Comté Électronique Mécanique- Thermique et Optique - Sciences et Technologies (UMR 6174) / FEMTO-ST
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation : Université de Franche-Comté (1971-....)
• Jury : Président / Présidente : Luc Buée
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Wilfrid Boireau, Thierry Burnouf, Céline Caille, Luc Buée, Rienk Nieuwland, Jérôme Dejeu, Jessica Gobbo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rienk Nieuwland, Jérôme Dejeu

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plaquettes sanguines

Imagerie médicale -- Appareils et matériel

Identification

Vésicules extracellulaires

Mots clés libres

Vésicules extracellulaires

Lysats de plaquettes humaines

Neuroprotection

Biodetection

Analyse exploratoire des données

Nanométrologie

Microparticules plaquettaires

Lysats de plaquettes

SPRI

AFM

Extracellular vesicles

Human platelet lysates

Neuroprotection

Biosensing

Explaratory data analysis

Nanometrology

EVs characterization

EVs nanometrology

Label-free EVs sensing

Neuroprotection

Platelet-EVs

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des structures vésiculaires hétérogènes de taille allant de 50 à 5000 nm. Elles sont libérées par tous les types de cellules et difficiles à distinguer en raison de leur hétérogénéité, du chevauchement de leurs propriétés physiques avec d'autres composants de milieux complexes tels que des agrégats protéiques, des lipoprotéines, etc.La plate-forme NanoBioAnalytique (NBA) a été développée en tant que solution analytique multiplexée pour une caractérisation efficace et sans marquage des VE. Il s'agit d'une technique de caractérisation multi-bio-physique composée d'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), de microscopie à force atomique (AFM) et de spectrométrie de masse (MS).Le premier axe de ce travail a consisté à évaluer les performances analytiques de la plateforme NBA pour un échantillon biologique complexe de VE, dérivées des plaquettes (PVE) fourni par l’Université Médicale de Taipei (TMU). Un format multiplex spécifique d'une biopuce a été conçu en utilisant des anticorps contre la protéine CD41 couramment exprimée dans les PVE. Les VEs sont immuno-capturées par une biopuce d'anticorps greffés à deux concentrations différentes et sur une plage de concentration couvrant 4 décades, suivi d’une nanocaractérisation in situ par AFM afin d’étudier leurs caractéristiques structurales et morphologiques. L'analyse quantitative des VE est également effectuée par le dénombrement des VEs, ainsi que par une analyse métrologique fine. Une méthode améliorée d'analyse des données a également été développée pour le traitement et l'analyse des données SPRi et AFM. Une méthode de sélection de seuil dynamique a été étudiée pour optimiser les paramètres de quantification de l'AFM. Les résultats ont démontré que la plateforme peut être sensible à une concentration de 106 VE/mL sans aucune stratégie d'amplification du signal. Il est également démontré que la plateforme NBA présente une plage dynamique linéaire sur au moins 3 ordres de grandeur (106-109 PEV/mL).Le deuxième volet du travail porte sur la caractérisation des VE dans diverses préparations de lysats plaquettaires humains (HPL) étudiées pour leur rôle en neuroprotection. Trois préparations, de lysats de plaquettes (PPL), traitées thermiquement (HPPL), ou lysats convertis en sérum (SCPL) ont été obtenues auprès de TMU. Différentes préparations de HPL s’avèrent en effet neuroprotectrices contre la toxicité cellulaire in vitro et la maladie de Parkinson in vivo ainsi que sur des modèles de traumatisme crânien. L'objectif de ce volet est de qualifier les VE dans ces trois types de produits. Une biopuce multiplexée dédiée au suivi de 7 marqueurs différents a été conçue pour l'étude via la plateforme NBA. Le phénotypage ainsi que la caractérisation des VEs ont indiqué qu'il existe une différence dans l'expression des phénotypes et des VEs dans ces différentes préparations.Ce travail permet d’établir la capacité de la plateforme NBA à caractériser les VE au sein d’échantillons complexes sans marquage et en format multiplexe. Les résultats obtenus permettent de positionner cette plateforme à la fois dans une approche exploratoire à des fins de recherche sur les VE mais également dans une perspective théranostique.Enfin, nous considérons que la plateforme NBA pourra apporter une contribution significative dans le domaine de la standardisation des méthodes de caractérisation des VE.La combinaison des données générées par la NBA, couplée à son potentiel résolutif, permettra de développer une grille d’évaluation à la fois globale et discriminante, car spécifique, de la nature des échantillons de VE. Cette métrique proposée, appelée « index cartographique EVs » (EVCI), sera utile pour évaluer la pureté, la composition vésiculaire (sous-populations), et la variabilité des préparations de VE. L'EVCI ainsi envisagée pourrait contribuer à l’établissement de normes internationales pour l'étalonnage et la caractérisation de préparations de VE.

Extracellular Vesicles (EVs) are heterogeneous vesicular structures ranging in size from 50 to 5000 nm. They are released by all types of cells and difficult to distinguish due to their heterogeneity, the overlap of their physical properties with other components of complex media such as protein aggregates, lipoproteins, etc.The NanoBioAnalytical (NBA) platform was developed as a multiplexed analytical solution for efficient and label-free characterization of EVs. It is a multi-bio-physical characterization technique composed of Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi), Atomic Force Microscopy (AFM) and Mass Spectrometry (MS).The first axis of this work consisted in evaluating the analytical performance of the NBA platform for a complex biological sample of EVs, derived from platelets (PEV) provided by Taipei Medical University (TMU). A biochip specific multiplex format was designed using antibodies against the CD41 protein commonly expressed in PEVs. EVs are immunocaptured by an antibody biochip grafted at two different concentrations. PEVs are tested over a concentration range spanning 4 decades, followed by in situ nanocharacterization by AFM in order to study their structural and morphological characteristics. The quantitative analysis of EVs is also carried out by counting EVs, as well as by a detailed metrological analysis. An improved data analysis method has also been developed for processing and analyzing SPRi and AFM data. A dynamic threshold selection method was studied to optimize AFM quantification parameters. The results demonstrated that the platform could be sensitive to a concentration of 10^6 EV / mL without any signal amplification strategy. It is also shown that the NBA platform exhibits a linear dynamic range over at least 3 orders of magnitude (10^6-10^9 PEV / mL).The second part of the work concerns the characterization of EVs in various preparations of human platelet lysates (HPL) studied for their role in neuroprotection. Three preparations, of Platelet Pellet Lysates (PPL), Heat-treated (HPPL), or Serum converted (SCPL) were obtained from TMU. Different HPL preparations have been shown to be neuroprotective against cell toxicity in vitro and Parkinson's disease as well as in Traumatic Brain Injury (TBI) models in vivo. The objective of this section is to qualify EVs in these three types of products. A multiplexed biochip dedicated to monitoring 7 different markers was designed for the study via the NBA platform. The phenotyping as well as the characterization of the EVs indicated that there is a difference in the expression of the phenotypes and the EVs in these different preparations.This work establishes the ability of the NBA platform to characterize EVs in complex samples without labeling and in multiplex format. The results obtained make it possible to position this platform both in an exploratory approach for research purposes on EVs but also in a theranostic perspective.Finally, we believe that the NBA platform will be able to make a significant contribution in the field of standardization of EV characterization methods. The combination of data generated by the NBA, coupled with its resolving potential, will allow the development of an evaluation grid that is both global and discriminating, because of its specificity to the nature of the EV samples. This proposed metric, called "EVs Consistency Index" (EVCI), will be useful in assessing the purity, vesicular composition (subpopulations), and variability of EV preparations. The envisaged EVCI could contribute to the establishment of international standards for the calibration and characterization of EV preparations.