Suivi et localisation en milieu cellulaire des complexes formés entre la protéine Gag du VIH-1 et l'ARN génomique par microscopie électronique à transmission

Tracking and localization of the complexes formed between HIV-1 Gag and genomic RNA by transmission electron microscopy in a cellular context

• Auteur / Autrice : Stéphanie Durand
• Direction : Hugues de Rocquigny
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé. Virologie
• Date : Soutenance le 21/10/2021
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Morphogénèse et antigénicité du VIH et des virus des hépatites et émergents. Tours
• Jury : Président / Présidente : Laurent Mereghetti
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marylène Mougel, Olivier Lambert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Serena Bernacchi, Olivier Mauffret

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines de liaison à l'ARN

Physiopathologie

Virus -- Reproduction (biologie)

Prévention

Infections à VIH

Membrane cellulaire

Nucléoprotéines

Microscopie électronique en transmission

Génomique

ARN viral

VIH (virus)

Mots clés libres

Vih-1

Assemblage

Protéine Gag

Microscopie Electronique à Transmission

ARN génomique

Hiv-1

Assembly

Gag

Transmission Electron Microscopy

Genomic RNA

Résumé

Durant l'assemblage du VIH-1, les protéines Gag nouvellement synthétisées se lient spécifiquement à l'ARN génomique viral (ARNg), entrainant la formation de petits complexes nucléoprotéiques. Consécutivement, des molécules additionnelles de Gag sont recrutées et ces complexes s'accumulent progressivement la membrane plasmique où l'assemblage et le bourgeonnement sont finalisés. Les précédents travaux publiés sur l'assemblage du VIH-1 ont essentiellement été réalisés par différentes approches de microscopie optique. Ils soulignent que des complexes Gag-ARNg se forment dans le cytoplasme et à la membrane plasmique et que le domaine NC de Gag est essentiel à leur formation et à leur traffic cellulaire. Les travaux réalisés durant cette thèse ont porté sur le suivi et la localisation cellulaire de Gag et de l'ARNg à haute résolution par microscopie électronique à transmission. Ces deux composants viraux forment majoritairement des complexes dans le cytoplasme puis migrent en direction de la membrane plasmique où des particules virales sont formées, dont environ un quart contiennent de l'ARNg. Une analyse morphométrique des complexes a permis de mettre en évidence que la distance entre Gag et l'ARNg diminue durant leur transport vers la membrane plasmique, souvent accompagné d'une augmentation de l'ARNg encapsidé. Des mutations ponctuelles dans les doigts de zinc du domaine NC provoquent une augmentation des distances entre Gag et l'ARNg ainsi qu'une diminution de l'ARNg encapsidé. Inversement, la délétion de la tige-boucle SL1 de l'ARNg n'empêche pas l'encapsidation de l'ARNg tandis que la délétion des deux tiges-boucles SL1-SL3 de l'ARNg est suffisante pour diminuer significativement la formation des complexes et l'encapsidation de l'ARNg. La formation de ces complexes est indépendante de la capacité de Gag à s'ancrer dans la membrane plasmique et du recrutement de la machinerie ESCRT par le domaine p6. Enfin, diverses approches de microscopie corrélative ont été expérimentées afin de relier une colocalisation de Gag et de l'ARNg à l'ultrastructure cellulaire entourant ces complexes. L'ensemble de ces travaux a permis de visualiser et de détecter à haute résolution et pour la première fois la formation de complexes nucléoprotéiques formés de Gag et de l'ARNg du VIH-1 de suivre finement leur évolution spatio-temporelle. Cette étude fourni une vision supplémentaire du processus d'assemblage viral en milieu cellulaire, rendant possible la localisation cellulaire abritant ces étapes du cycle du VIH-1.Mots-clés : VIH-1, Assemblage, Gag, ARN génomique, Microscopie Électronique à Transmission

The present view of HIV-1 assembly stipulates that newly made Gag precursor molecules kick-start virus assembly upon binding to the viral genomic RNA (gRNA), causing the formation of low-order oligomeric ribonucleoprotein complexes. Consequently, more Gag molecules are recruted and these complexes gradually accumulates at the plasma membrane of the infected cell to complete viral assembly and budding. Previous studies on HIV-1 assembly have been performed using optical microscopy techniques. They underline that Gag-gRNA complexes are formed in the cell cytoplasm and at the plasma membrane. Gag NC domain is essential for their formation and their cellular trafficking. In this work, the intracellular localization of these complexes was tracked and studied by transmission electron microscopy. Formation of these viral clusters seem to occur soon after the nuclear export of the gRNA and this is followed by a traffic toward the plasma membrane where viral particles are formed, one quarter containing gRNA. A morphetrical analysis of these complexes show that during their transport to the plasma membrane, the distance between Gag and gRNA decreases together with an increase of gRNA packaging. Point mutations in the GagNC zinc fingers caused an increase in the distance between Gag and the gRNA together with a large decrease of the packaged gRNA into virions. Conversly, deletion of the gRNA-SL1 does not interfere with gRNA packaging while deletion of SL3 is sufficient to decrease but not abolish Gag-gRNA cluster formation and gRNA packaging. The formation of these complexes is neither dependant of Gag abilty to anchor in the plasma membrane nor of ESCRT machinery recruitment by p6. Finaly, some correlative microscopy techniques have been used in order to link a colocalisation phenotype between Gag and gRNA with the surrounding cell ultrastructure. All this work sheds new light on HIV- 1 assembly and allow for the first time a high resolution visualization and detection of nucleoproteic complexes formed by HIV-1 Gag and gRNA in a cellular context all along with a fine quantitative analysis. This original approach could be used to study other viral assembly models or more generally RNA/protein interactions.Key words: HIV-1, Assembly, Gag, gRNA, Transmission Electron Microscopy