Phénotypage métabolomique multi-matrices biologiques et multi-plateformes analytiques

Metabolomic phenotyping of biological samples with analytical platforms

• Auteur / Autrice : Cécile Martias
• Direction : Patrick Emond, Lydie Nadal-Desbarats
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 16/12/2021
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Imagerie et cerveau (Tours)
• Jury : Président / Présidente : Igor Chourpa
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Karen Plé, Justine Bertrand-Michel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurence Le Moyec, Benoît Maunit
• DOI : 10.70675/4d6cfde4z1577z44dfz8539zcc9de17a60dd

Mots clés

Mots clés contrôlés

Métabolisme

Métabolites

Chèvre domestique -- Élevage

Médecine vétérinaire préventive

Analyse qualitative (chimie)

Analyse quantitative (chimie)

Exploration fonctionnelle

Petites molécules

Échantillons biologiques

Métabolomique

Phénotype

Mots clés libres

Métabolomique

Biologique

Marquage de fonctions chimique

Metabolomic

Biological

Chemical derivatization

Résumé

Un des objectifs de la métabolomique est d’identifier et quantifier l'ensemble des molécules (métabolome) d’échantillons prélevés d'un individu. Cette image métabolique instantanée permet de caractériser l’état de santé de cet individu puis de suivre son évolution. Par ailleurs, la comparaison de cet état métabolique à des situations pathologiques permet l’identification de biomarqueurs de diagnostic, de pronostic et le suivi de la réponse à un traitement. Ces objectifs nécessitent de disposer d’outils d’exploration du métabolome qui puissent être standardisés, les plus larges possibles et quantitatifs. L’objectif de ce projet est la mise au point de procédures standardisées et quantitatives d’exploration du métabolome chez l’humain et le caprin.Dans une première partie, nous nous sommes proposés de développer une méthodologie robuste capable de décrire le métabolome le plus complet possible d'un individu. Pour se faire, différents types d’échantillons ont été utilisés : sang, urine, fèces et salive chez l’Homme ; sang, lait et fèces chez la chèvre. L’ensemble de ces prélèvements a été analysé à l’aide de plateformes analytiques multiples (Résonance Magnétique Nucléaire et Spectrométrie de Masse). Afin de répondre à des contraintes d’analyses à haut débit et transférables en routine de biologie médicale, nous avons recherché un compromis entre la réduction de l’étape pré-analytique et la description métabolique la plus exhaustive possible. Ainsi, une préparation unique de chaque échantillon pour les plateformes LC (RP-LC et HILIC) – Q Orbitrap et 1H-RMN a été privilégiée. Les critères de choix de la meilleure préparation sont le nombre de métabolites détectés et la variabilité analytique obtenue. L’ensemble des expériences et résultats obtenus pour les prélèvements humains est décrit dans la publication (Martias et al. Molecules 2021, 26(14), 4111). Ce travail propose également la représentation des données sous la forme d’une carte métabolomique individuelle. Celle-ci pourrait être utilisée ultérieurement lors d’étude clinique. La même approche méthodologique a été effectuée pour l’analyse du métabolome caprin. Avec comme objectif final de pouvoir détecter la présence de maladies telles que les mammites. Ce travail est réalisé en partenariat avec la société Allice (Nouzilly, France) et est présenté dans la publication (Martias et al. Metabolites 2021, 11(10), 681). Cette étude propose l’accès de façon fiable à un métabolome sous forme d’atlas et peut permettre la recherche de biomarqueurs de diagnostic chez le caprin, pour le suivi de l’état de santé des troupeaux pour une détection très précoce de la mise en place de pathologie dans un élevage.Dans une seconde partie, nous avons débuté un travail afin de répondre à la problématique de quantification du métabolome par spectrométrie de masse. Les méthodologies proposées utilisent des dérivations de groupes chimiques tels que les acides carboxyliques au moyen d’étiquettes chimiques (Tag). Quatre Tags utilisant le couplage peptidique ont été testés avec 3 agents de couplage. Ces protocoles ont été testés dans un premier temps avec des standards afin de sélectionner les meilleurs étiquette et agent de couplage. Cependant, cette approche de marquage en deux étapes induit des variabilités importantes de rendement d’incorporation. Un développement méthodologique mono-étape sans agent de couplage est à privilégier.L’ensemble de ce travail a permis la mise en évidence des avantages de l’exploration du métabolome par une approche multi-matrices et multiplateformes chez l’humain et le caprin. Ces méthodes permettent d’obtenir une couverture métabolique importante de manière robuste. Cette approche pourrait être transférée en santé animale ou humaine. Afin d’avoir une information longitudinale, le développement de méthodes de quantifications est une étape clé. Dans ce but, ce développement quantitatif sera poursuivi avec des protocoles mono-étape.

One of the aim of metabolomics is to identify and quantify the entire scope of molecules (metabolome) from samples withdrawn from an individual. This instantaneous metabolic image allows to characterize the health status of this individual and to follow his evolution. In addition, the comparison of this metabolic state with pathological situations allows the identification of diagnostic biomarkers, prognosis but also the following of a treatment response. These objectives require the availability of tools for the exploration of metabolome that can be standardized, as exhaustive as possible and quantitative. The objective of this project is development of standardized operating procedure and quantitative procedures for the exploration of metabolome for humans and for goats.In the first part, we focus on the development of a robust methodology able to describe the most complete metabolome as possible of an individual. To achieve our goal, different types of samples were used: blood, urine, faeces and saliva from humans. and blood, milk and faeces have been used for goats. All samples were analyzed using multiple analytical platforms (Nuclear Magnetic Resonance and Mass Spectrometry). The objective was to meet the constraints of high throughput analyzes that can be transferred to routine medical biology. We looked for a compromise between reducing the pre-analytical step while preserving the most exhaustive metabolic description possible. Thus, a unique preparation of each sample was privileged for the LC (RP-LC and HILIC) - Q Orbitrap and for 1H-NMR platforms. The process to select the suitable preparation took in consideration the number of detected metabolites and the analytical variability. All the experiments and results obtained for human samples are described in the publication (Martias et al. Molecules 2021, 26 (14), 4111). This work also proposes the representation of data in the form of an individual metabolomic map. This map could be used later in some clinical study. The same methodological approach was carried out for the analysis of the goat metabolome. With the final objective of being able to detect the presence of diseases such as mastitis. This activity has been carried out in partnership with the company Allice (Nouzilly, France) and is presented in the publication (Martias et al. Metabolites 2021, 11 (10), 681). The study provides reliable access to a metabolome in the form of an atlas. It may allow the search for diagnostic biomarkers in goats, for monitoring the health status of herds. It could also permit very early detection of the development of pathology in a goat farm.In a second part, we initiated the process to find an approach for the quantification problem of the metabolome by mass spectrometry. The proposed methodologies use derivations of chemical groups such as carboxylic acids by means of chemical labels (Tag). Four Tags using peptide coupling were tested with 3 coupling agents. These protocols were first tested with acid standards in order to select the suitable Tag and the suitable coupling agent. However, this two-steps labeling approach induces significant variability in incorporation yield. A single-step methodological development without coupling agent is to be privileged.All of this work has demonstrated the advantages of exploring the metabolome using a multi-matrix and multiplatform approach for humans and for goats. These methods allow to obtain a significant metabolic coverage. Thus it describes a large number of metabolic pathways in a robust manner. This approach could be transferred to animal or to human health. In order to have longitudinal information on animal and human health, the development of quantification methods is a key step. For this purpose, the development of quantitative methods will be continued with the single-step protocols.