Le système CRISPR-Cas de type II-A des souches hypervirulentes de Streptococcus agalactiae : rôle et spécificités

Functional study of the type II-A CRISPR-Cas system from different phylogenetic lineages of Streptococcus agalactiae

• Auteur / Autrice : Adeline Pastuszka
• Direction : Philippe Lanotte
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 15/09/2021
• Etablissement(s) : Tours
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Infectiologie et santé publique (Tours)
• Jury : Président / Présidente : Claire Poyart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Horvath, Sylvain Moineau, Virginie Hervé
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sophie Payot-Lacroix, David Bikard

Mots clés

Mots clés contrôlés

Régulation génétique

Promoteurs (génétique)

Transcription génétique

Virulence (microbiologie)

CRISPR (génétique)

Pathogénicité

Streptococcus agalactiae

Mots clés libres

Streptococcus agalactiae

CRISPR-Cas

St17

Hypervirulence

Fonctionnalité

Régulation

Streptococcus agalactiae

CRISPR-Cas

St17

Hypervirulence

Functionality

Regulation

Résumé

Les systèmes CRISPR-Cas représentent un mécanisme important de défense développé par les bactéries, composés de deux grandes régions : le locus CRISPR, constitué d’unités repeat-spacer et l’opéron cas, codant les protéines effectrices du système. S. agalactiae, pathogène humain majeur de la période néonatale et pathogène émergent chez l’adulte, possède un système CRISPR1, de type II-A, composé des gènes cas9, cas1, cas2 et csn2. Des travaux préliminaires ont amorcé l’ébauche d’un lien entre la virulence de cette bactérie, associée principalement aux souches de ST17 et la fonctionnalité de son système CRISPR1-Cas. En effet, ces souches hypervirulentes possèdent significativement moins de spacers que les souches des autres lignées phylogénétiques. Afin d’expliciter ces différences, nous avons centré notre travail sur l’étude de la région promotrice en amont de l’opéron cas. L’alignement des séquences de cette région a mis en évidence une délétion de 103 paires de bases chez les souches de ST17, entrainant la disparition du promoteur de l’opéron cas. L’expérience de fusion transcriptionnelle confirme l’absence d’activité de ce promoteur chez ces souches, corroborée par l’analyse par RT-PCR quantitative, qui montre une expression très faible de cas9. Alors que ces résultats confortent l’hypothèse d’un système CRISPR1-Cas moins actif chez les souches de ST17, l’expérience d’interférence réalisée par la suite, a montré que le système semble tout de même conserver sa capacité de mécanisme de défense vis à vis d’une séquence nucléotidique déjà acquise. De même, nous avons démontré pour la première fois in vitro, la capacité d’intégration de nouveaux spacers au sein du locus CRISPR1 des souches de ST17. Nous avons attribué la fonctionnalité du système CRISPR1-Cas chez les souches hypervirulentes à la présence d’un autre promoteur, Psrn036, situé en amont de l’opéron cas, suffisant et essentiel pour sa transcription. De plus, nous avons également montré que ce promoteur était régulé par CovR, le régulateur majeur de virulence chez S. agalactiae, pouvant potentiellement expliquer les différences observées entre le faible niveau de transcription des gènes cas et l’efficacité du système chez les souches hypervirulentes du ST17. Il semble donc exister des mécanismes de régulation du système CRISPR1-Cas de S. agalactiae, spécifiques des lignées phylogénétiques, pouvant participer à l’évolution de l’espèce et à son adaptation à l’Homme, en contrôlant par exemple la diversité génétique liée aux éléments génétiques mobiles.

CRISPR-Cas systems are an important defense mechanism developed by bacteria, composed of two major regions: the CRISPR locus, which is an alternation of repeats and spacers, and the cas operon, encoding the effector proteins of the system. S. agalactiae, a major human pathogen responsible for invasive neonatal infections and an emerging pathogen in adults, possesses a type II-A system, CRISPR1, characterized by cas9, cas1, cas2 and csn2 genes. Previous work has established a link between the virulence of this bacterium, mainly associated to ST17 strains, and the functionality of the CRISPR1-Cas system. Indeed, the hypervirulent strains possess significantly fewer spacer in their CRISPR1 locus, than the strains belonging to other phylogenetic lineages. In order to investigate these differences, we focused on studying the promoter region upstream cas operon. Sequence alignment performed on this region, revealed a 103 bp deletion in the ST17 strains, resulting in Pcas deletion. We performed transcriptional fusion experiments which have confirmed the absence of promoter activity, corroborated by RT-qPCR analysis, which revealed very low expression of cas9. While these results support the hypothesis that the ST17 CRISPR1-Cas system might not be properly functioning, we have demonstrated that the system remains capable of cleaving an already encountered foreign element. Moreover, we have demonstrated, for the first time in vitro, the capacity of the ST17 system to acquire new spacers in its CRISPR1 locus. We attributed the functionality of the CRISPR1-Cas system of the hypervirulent strains to the presence of another promoter, Psrn036, located upstream cas operon, essential and sufficient for the transcription of cas genes. In addition, we demonstrated that this promoter is regulated by CovR, the major regulator of S. agalactiae virulence. This regulation may explain the differences observed between cas9 low levels of transcription and the efficiency of the CRISPR1-Cas system in hypervirulent strains. Some mechanisms seem able to regulate CRISPR1-Cas expression, particularly in specific phylogenetic lineages, thus participating in species evolution and adaptation to humans by controlling genetic diversity linked to mobile genetic elements.