Implication d'exoribonucléases 3'-5' dans la maturation des ARN ribosomiques chez l'Homme

Involvement of 3'-5' exoribonucleases in the maturation of human ribosomal RNAs

• Auteur / Autrice : Maxime Aubert
• Direction : Pierre-Emmanuel Gleizes, Marie-Françoise O'Donohue
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 23/07/2021
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Unité de biologie moléculaire, cellulaire et du développement (Toulouse ; 2021-....)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Belenguer
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Dominique Weil, Stéphane Thore, Micheline Fromont-Racine

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transférases

ARN ribosomiques

Mots clés libres

Ribosomes

ARNr

Uridylation

Modifications post-transcriptionnelles

Terminal Uridyl transférases

3'-5' ExoRNases

3'RACE-Seq

Post-transcriptional modifications

Terminal Uridyl transferases

Résumé

La biogenèse des ribosomes nécessite quatre ARN ribosomiques (ARNr ; 5S, 18S, 5.8S et 28S) pour former les squelettes de la petite et de la grande sous-unité des ribosomes. Les ARNr 18S, 5,8S et 28S proviennent d'un transcrit primaire, le pré-ARNr 47S, dans lequel ces séquences sont flanquées d'espaceurs transcrits externes (5'ETS, 3'ETS) et séparées par des espaceurs transcrits internes (ITS1, ITS2). La formation des ARNr matures résulte de l'association séquentielle des protéines ribosomiques assistées de facteurs d'assemblage, ainsi que d'un enchaînement complexe d'étapes de maturation des ARNr, incluant repliements, modifications de nucléotides, et élimination progressive des espaceurs transcrits. Des études récentes ont révélé une complexité accrue de ce processus durant l'évolution, impliquant notamment des exoribonucléases (exoRNases) 3'-5' pour assurer la maturation de l'ARNr 18S chez l'Homme. Durant ma thèse, j'ai poursuivi la caractérisation de plusieurs intermédiaires de maturation en combinant le knock out d'enzymes d'intérêt à l'aide du système CRISPR/Cas9, la déplétion par des duplex de siARN, et une méthode d'analyse de 3' RACE suivie d'un séquençage à haut débit. Mes travaux ont conduit à une description détaillée des étapes de maturation nucléaires et cytoplasmiques du dernier précurseur de l'ARNr 18S, le pré-ARNr 18S-E, et ont confirmé les données publiées précédemment qui suggéraient que la digestion 3'-5' de l'ITS1 après le clivage au site E est un processus exonucléolytique. Le schéma de maturation, qui est semblable dans les différentes lignées cellulaires humaines testées, suit une cinétique très rapide qui définit un nouvel intermédiaire, le pré-ARNr 18S-E', portant ~9 nucléotides en 3' de l'ARNr 18S. La dégradation exonucléolytique est amorcée par plusieurs étapes d'adénylation assurées par TENT4A et TENT4B dans le noyau, mais aussi par d'autres poly(A) polymérases nucléaires ou cytoplasmiques encore non identifiées. En outre, l'ajout de courtes séquences d'uridines par TUT4 et TUT7 dans le cytoplasme permet la progression au sein d'une tige boucle très structurée. Mes résultats montrent enfin que l'exoRNase DIS3L2 est impliquée dans la dégradation de l'ITS1, mais qu'elle pourrait plutôt prendre part à un système de surveillance régulant la dégradation des particules pré-ribosomiques ne pouvant être prises en charge pour la maturation. Dans un 2ème volet, j'ai démontré l'implication de l'exoRNase ISG20L2 à la fois dans la maturation de l'extrémité 3' de l'ARNr 28S, et dans celle d'un précurseur de l'ARNr 18S, le pré-ARNr 21S. Grâce à la puissance de l'analyse NGS, mes travaux de thèse apportent une compréhension nouvelle des mécanismes de la maturation de l'extrémité 3' des ARNr 18S et 28S et démontrent l'existence de mécanismes non décrits jusqu'à présent.

Ribosome biogenesis necessitates four ribosomal RNAs (rRNAs; 5S, 18S, 5.8S and 28S) to form the skeleton of the small and large ribosomal subunits. The 18S, 5.8S and 28S rRNAs derive from the 47S primary transcript, in which these sequences are flanked by external transcibed spacers (5'ETS, 3'ETS) and separated by internal transcibed spacers (ITS1, ITS2). Mature rRNA synthesis arises from the sequential association of ribosomal proteins assisted by ribosomal assembly factors, together with complex rRNA processing steps, including precise foldings, nucleotide modifications, and progressive elimination of the transcribed spacers. Recent studies have unraveled the increasing complexity of this process during evolution, involving in particular 3'-5' exoRNases to ensure human 18S rRNA maturation. During my Ph.D. thesis, I performed the characterization of several maturation intermediates by combining the knockout of enzymes of interest thank to the CRISPR/Cas9 technology or their depletion with siRNA duplexes, together with a 3' RACE technique followed by high throughput sequencing. These experiments have allowed me to describe in details the nuclear and cytoplasmic processing steps of the last precursor to the 18S rRNA, the 18S-E pre-rRNA, and have confirmed previously published data which suggested a 3'-5' exonucleolytic trimming of ITS1 following the release of 18S-E pre-rRNA upon cleavage at site E. The maturation scheme, which was similar in all the human cell lines that I have tested, follows a very rapid kinetics and leads to a newly-described intermediate, the 18S-E' pre-rRNA, which bears a ~9 nucleotide-long extension in 3' of the 18S sequence. The exonucleolytic trimming of 18S-E precursors is primed by adenylation, a non-templated addition performed in the nucleus by TENT4A and TENT4B, although other nuclear and cytoplasmic poly(A) polymerases, still unidentified to date, also participate in this process. Moreover, short additions of non-templated uridines by TUT4 and TUT7 allow progression of exoRNase(s) through a highly structured stem loop, a step which occurs in the cytoplasm. My results also showed that DIS3L2 is involved in ITS1 degradation, although this 3'-5' exoRNase might belong to a surveillance pathway regulating the degradation of pre-40S particles whose maturation cannot be pursued. In a second part of my work, I demonstrated the involvement of ISG20L2 during the maturation of the 3' extremity of 28S rRNAs, and of that of 21S pre-rRNA, another precursor to the 18S rRNA. Thanks to the high potential of NGS analyses, the data obtained in the course of my Ph.D. thesis provide a better understanding of the molecular mechanisms leading to mature 18S and 28S rRNAs and bring new insights in so-far undescribed steps of ribosome biogenesis.