Développement d'un test phénotypique d'activité de la protéine O-mannosyltransférase de Mycobacterium tuberculosis pour la recherche d'inhibiteurs à fort potentiel thérapeutique

Development of a phenotypic activity assay of Mycobacterium tuberculosis O-mannosyltransferase protein activity for the search of inhibitors with high therapeutic potential

• Auteur / Autrice : Nicolas Geraud
• Direction : Michel Rivière, Emeline Fabre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance le 23/11/2021
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie et de biologie structurale (Toulouse ; 1996-....)
• Jury : Président / Présidente : Laurent Maveyraud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marie-Ange Krzewinski-Recchi, Marcelo Guerin, Jean-Louis Herrmann

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glycomique

Tuberculose

Transférases

Mots clés libres

Glycosyltransférase

Tuberculose

Antivirulence

Glycobiologie

Glycosyltransferase

Tuberculosis

Antivirulence

Glycobiology

Résumé

L'antibiorésistance ou résistance acquise des bactéries aux antibiotiques est en passe de devenir l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le développement d'approches pharmacologiques antibactériennes novatrices constitue un enjeu vital face à cette ''urgence sanitaire mondiale du XXIème siècle'' (déclaration ONU du 21/09/2016). Il apparait aujourd'hui que la recherche de composés ciblant les facteurs de virulence responsables des manifestations cliniques, mais non essentiels à la croissance de la bactérie pourrait constituer un des concepts des plus novateurs et prometteurs pour lutter contre l'antibiorésistance. De telles molécules dépourvues d'activité microbicide per se, exerçant une faible pression de sélection sur l'écosystème microbien, ne favoriseraient pas l'émergence de résistance et seraient dénuées des effets indésirables des antibiotiques conventionnels sur le microbiote commensal de l'hôte. Dans ce contexte, lors de précédents travaux l'équipe a démontré que la mannosylation des protéines mycobactériennes n'est pas indispensable à la survie bactérienne, mais est essentielle à la virulence de Mycobacterium tuberculosis, agent étiologique de la tuberculose. Ceci nous a conduits à proposer l'enzyme Protéine O-mannosyltransférase PMTub, responsable de la mannosylation des protéines mycobactériennes, comme un ''facteur de virulence non-essentiel'' pouvant conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la tuberculose. En utilisant la modélisation moléculaire 3D, nous avons identifié un domaine fonctionnel spécifique de cette enzyme, appelé EL4, que nous prédisons être impliqués dans la reconnaissance des protéines substrats. Afin de valider cette hypothèse nous avons développé un test d'activité phénotypique original qui nous a permis d'en réaliser une analyse fonctionnelle par mutations ponctuelles. Les résultats obtenus démontrent pour la première fois l'implication de ce domaine spécifique dans l'activité des isoenzymes bactériennes. De plus, le développement d'approches moléculaires complémentaires in vitro apportent des éléments préliminaires de compréhension du rôle de ce domaine dans l'activité de PMTub. Ces données nous ont permis d'initier la conception d'un test original de détection in-situ sur bactérie de l'interaction moléculaire entre ce domaine EL4 spécifique de PMTub et un substrat cible. Ces travaux ont pour objectifs la mise au point d'un test phénotypique innovant de criblage de composés inhibiteurs dirigés contre la cible PMTub sur bactérie vivante. De tels composés spécifiquement actifs sur l'enzyme bactérienne et sans effets croisés sur les isoenzymes humaines pourraient ouvrir la voie au développement de nouvelles molécules à haut potentiel thérapeutique contre les infections mycobactériennes.

The antimicrobial resistance has been declared as a ''fundamental threat'' to global health and safety at the first general assembly meeting on drug-resistant bacteria (UN, 21/09/2016). The development of innovative pharmacological anti-bacterial strategies constitutes a vital issue to face this worldwide health threat. In this regard, a novel promising concept is emerging which consist of targeting the so-called ''non-essential bacterial virulence factors''. Such original drugs that would target Mycobacterium tuberculosis virulence factors during host colonization without directly impacting bacterial essential physiological processes are less likely to favor the development of drug resistance while still weakening the pathogen's fitness and rendering it more sensitive to immune system attack. Moreover, anti-virulence drugs are not supposed to target the host microbiota, and therefore may show fewer side effects than classical antibiotics. In this context, the team recently reported that the Mycobacterium tuberculosis Rv1002c protein O-mannosyltransferase (PMTub) is dispensable for M. tuberculosis growth but essential for its virulence in cellular and animal models. PMT activity impacts on a large number of bacterial glycosylated proteins that contribute to M. tuberculosis virulence and targeting PMT may thus result in a pleiotropic anti-virulence effect. Using 3D molecular modeling, we have identified a specific functional domain of this enzyme, called EL4 that we predict to be involved in the recognition of protein substrates. In order to validate this hypothesis, we developed an original phenotypic activity assay taht allowed us to perform a functional analysis by point mutations. The results obtained demonstrate for the first time the involvement of this specific domain in the activity of bacterial enzymes. In addition, the development of complementary in vitro molecular approaches provide preliminary elements for understanding the role of this domain in PMTub activity. These data allowed us to initiate the design of an original test for in-situ detection on bacteria of the molecular interaction between this specific EL4 domain of PMTub and a target substrate. This project aims to develop an innovative assay for the detection of the molecular interaction between a reporter protein substrate of PMTub and the specific domain EL4. Such a strategy will then allow the selection of inhibitors of this recognition, which do not affect the human iso-enzymes, and therefore suitable for the future development of new anti-tuberculous compounds harmless for the host, targeting the virulence factor PMTub.