Effets des immunosuppresseurs et des microparticules membranaires sur la transition épithélio-mésenchymateuse des cellules épithéliales bronchiques en culture 2D et 3D : intérêt en transplantation pulmonaire

Effects of immunosuppressive drugs and membrane microparticles on epithelial-mesenchymal transition of bronchial epithelial cells in 2D and 3D culture : interest in lung transplantation

• Auteur / Autrice : Margaux Gracyasz
• Direction : Romain Kessler, Anne Olland
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Pharmacologie-pharmacocinétique
• Date : Soutenance le 03/12/2021
• Etablissement(s) : Strasbourg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Regenerative NanoMedicine (Strasbourg ; 2018-2022)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Caillard
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Le Pavec
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Federica Meloni, Antoine Magnan

Mots clés

Mots clés contrôlés

Immunosuppresseurs

Transplantation pulmonaire

Transition épithélio-mésenchymateuse

Mots clés libres

Bronchiolite oblitérante

Transplantation pulmonaire

Traitement immunosuppresseur

Transition épithélio-mésenchymateuse

Chronic lung allograft dysfunction

Bronchiolitis obliterans

Lung transplantation

Immunosuppressives drugs

Epithelial-mesenchymal transition

Résumé

La bronchiolite oblitérante (BO) est caractérisée par un remodelage anormal de l’épithélium bronchique causant une oblitération fibreuse de la bronchiole. Un des mécanismes impliqués est la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). La TEM pourrait être favorisée par des facteurs allo-immuns (infections) ou non-allo-immuns (Immunosuppresseur (IS)). Cette étude s’intéresse à l’impact d’un facteur non-immuns, les IS et plus particulièrement le Tacrolimus (TAC) et Everolimus (EVE). Le développement d’un modèle 3D est nécessaire pour mieux comprendre les interactions cellulaires et le phénomène de TEM induite par les IS. Méthodes. BEAS-2B, cellules épithéliales bronchique sont soumis à TAC (1-20μM), EVE (0,1nM-1μM) et à un stress pro-inflammatoire (microparticules pro-inflammatoires, MPs) (30nM) pendant 72 h. Les MPs sont obtenus par la stimulation des monocytes THP-1 par le lipopolyssacharide de Pseudomonas aeruginosa. La morphologie cellulaire a été analysé par microscopie otique et confocal, analyses des marqueurs épithéliaux et mésenchymateux par western blot et de la capacité migratoire par scratch test. Pour la formation de sphéroïdes, 3 concentrations de cellules 10 000, 50 000 et 100 000 cellules ont été utilisées. Les sphéroïdes ont été analysées après 7 jours d’incubation au microscope optique et confocal. Résultats : les cellules traitées par TAC and EVE ont modifié leur morphologie cellulaire et ont un profil mésenchymateux avec une baisse significative de la E-cadhérine avec TAC10μM and EVE0.,1nM comparé au cellules non traitées (p<0,0001) et (p<0,001) respectivement et une augmentation significative de la vimentine avec TAC10μM et EVE0,1nM comparé aux cellules non traitées (p=0,0005)et (p<0,05) respectivement. Les sphéroïdes à 10 000, 50 000 et 100 000 cellules ont un diamètre de250μm, 520μm et 620μm respectivement. A 100 000 cellules, la partie distale es sphéroïdes expriment de la vimentine, alors que le reste expriment la E-cadhérine. Conclusion : In vitro, le TAC et EVE combiné aux MPs pro-inflammatoires conduit en faveur d’une exagération de la TEM. Le prescripteur pourrait considérer la statue inflammatoire du patient transplanté. Le modèle 3D permettra d’avoir une présentation plus fidèle afin d’étudier les effets des IS des médicaments en diffusant par voie basale et non apicale.

Bronchiolitis obliterans syndrome (BOS) is characterized by an abnormal remodeling of the bronchial epithelium causing fibrotic obliteration of the bronchiole. One of the mechanisms involved is the epithelial-mesenchymal transition (EMT). This EMT could be favored by allo-immunefactors such as infections but also by non-immune factors such as immunosuppressive drugs (IS). This study focuses on the impact of non-immune factors, IS and more especially Tacrolimus (TAC) and Everolimus (EVE). The development of a 3D model is necessary to better understand cellular interactions and the phenomenon of EMT induce by IS. Methods: BEAS-2B, bronchial epithelial cells were submitted to TAC (1-20μM), EVE (0,1nM-1μM) and/or pro-inflammatory stress (microparticles pro-inflammatory) (30nnM) for 72h. Pro-inflammatory MPs were harvested from LPS of Pseudomonoas aeruginosa-stimulated monocytes THP1, washed et concentrated. Cells were used to test TAC, EVE and MPs. Cellular morphology was analyzed by optical microscopy and confocal, epithelial, and mesenchymal markers by Western blot and migratory cell capacity by scratch-test. For the spheroid’s formation, 3 cells concentrations 10 000, 50 000 and100 000 cells are used. Spheroid are analyzed 7 days after incubation in optical microscopy and confocal. Results : Cells treated by TAC and EVE had modified cellular morphology and a mesenchymal profile with a significant down-regulation in E-cadherin with TAC10μM and EVE0,1nM compared to untreated cells (p<0.0001) and (p<0.001) respectively, and a significant up-regulation in vimentin with TAC10μMand EVE0.1nM compared to untreated cells (p=0.0005) and (p<0.05) respectively. Spheroid at 10 000, 50 000 and 100 000 cells had a diameter of 250μm, 520μm and 620μm respectively. At 100 000 cells, distal part of spheroids expressed vimentine whereas the rest of spheroid, the center, express E-cadherin. Conclusion: In vitro, TAC and EVE combined to pro-inflammatory MPs lead to favor exaggerated EMT. Immunosuppression regimens should consider the inflammatory status of lung transplanted patients. 3D model allows to have a better representation to study the effects of IS by basal pathway diffusing.