Développement de systèmes optiques avancés pour la manipulation des neurones avec une haute résolution spatiale et temporelle

Development of advanced optical systems for spatially and temporally precise brain interrogation

• Auteur / Autrice : Clément Molinier
• Direction : Valentina Emiliani
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 09/12/2021
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Alexandra Fragola
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Hervé Rigneault, Tommaso Fellin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Processus à plusieurs photons

Holographie en médecine

Réseaux neuronaux (physiologie)

Optogénétique

Mots clés libres

Optogénétique

Photostimulation

Modulation de phase

Focalisation temporelle

Microendoscope

Excitation à deux photons

Contraste de phase généralisé

Focalisation temporelle

Optogenetics

Photostimulation

Wave frontshaping

Temporal focusing

Microendoscope

Two-photon excitation

Generalized phase contrast

Temporal focusing

Résumé

Avec la découverte de l'optogénétique, l’utilisation de la lumière est devenue essentielle pour étudier et contrôler l'activité et la connectivité neuronales. Cependant, la complexité des circuits cérébraux exige d’employer des méthodes optiques avancées pour toute investigation approfondie de son fonctionnement. C’est pourquoi, l'un des plus grands défis optiques est d'atteindre des cibles multiples avec une résolution cellulaire et une bonne précision temporelle dans les régions les plus profondes du cerveau. Au cours de cette thèse, j'ai travaillé sur trois nouveaux systèmes optiques afin d'apporter une réponse possible à certains de ces défis techniques. Premièrement, nous avons développé un nouveau système de génération de formes lumineuses focalisées dans le temps (MTF-LS) pour la photostimulation précise en 3D des neurones. Grâce à la flexibilité de cette nouvelle approche, différentes méthodes de modelage de la lumière ont put être utilisées: l'holographie générée par ordinateur (CGH) ou le contraste de phase généralisé. Avec ces deux approches, le système était limité à la multiplication en 3D d'une seule forme à la fois. Pour résoudre ce problème, nous avons proposé une technique innovante de modulation amplitude/phase, pour générer différentes formes en 3D. En raison de l'absorption et de la diffusion, il est difficile de stimuler des cellules au-delà de ~ 600 µm de tissu cérébral avec une méthode de stimulation à deux photons (2P). Face à des limitations similaires en matière d'imagerie, d'autres laboratoires ont utilisé des lentilles à gradient d'indice (GRIN) implantées dans le cerveau pour accéder à des régions profondes. Nous avons donc développé une nouvelle méthode de photostimulation en profondeur, en couplant une lentille GRIN avec le MTF-LS précédemment démontré. Ce système représente le premier microendoscope capable de générer des dizaines de sites d'excitation 2P, confinés axialement et correspondant aux dimensions du soma d’un neurone cible dans un volume 3D. Troisièmement, pour manipuler l'activité neuronale à des échelles temporelles inférieures à la milliseconde et/ou de grandes populations de cellules, nous avons construit un nouveau système utilisant le ciblage lumineux séquentiel ultra-rapide (FLiT). Nous sommes parvenus à contrôler le retard d’activation entre deux cellules avec une résolution temporelle de l'ordre de la microseconde. Nous avons également démontré un nouveau protocole de stimulation où l'optimisation du temps d'illumination permet de stimuler cinq fois plus de cellules que l'illumination statique conventionnelle pour la même puissance laser.

With the discovery of optogenetics, using light becomes essential to study and control neural activity and connectivity. However, the complexity of the brain circuits demands advanced optical methods for detailed investigation. One of the most significant optical challenges is to address multiple targets with cellular resolution and high temporal precision in deep brain regions. During this thesis, I worked on three new optical systems to provide a possible answer to some of these technical challenges. First, we developed a new system to multiplex temporally focused light shapes (MTF-LS) for precise 3D photostimulation of neurons. Thanks to the flexibility of this new approach, different light-shaping methods can be applied: either computer-generated holography (CGH) or speckle-free generalized phase contrast. With these two approaches, the system was limited to multiplex only one shape at the time. To solve this issue we demonstrate an innovative amplitude/phase modulation technique, to multiplex different shapes in 3D. Due to the absorption and scattering, it is difficult to stimulate cells beyond ~ 600 µm of brain tissue with two-photon (2P) stimulation technique. Facing similar limitations in imaging, other laboratories used gradient index (GRIN) lenses implanted in the brain to access deep regions. Thus we develop a new in-depth photostimulation method, by coupling a GRIN lens with the MTF-LS previously demonstrated. This system represented the first microendoscope capable of generating tens of axially confined 2P excitation patterns matching target neuronal soma in a 3D volume for in-depth experiments. Third, to manipulate neuronal activity at sub-millisecond temporal scales and large cell populations, we built a new system using ultra-fast sequential light targeting (FLiT). We managed to control the spike delay among two cells with s temporal resolution. We also demonstrate a new stimulation protocol where the illumination time optimization allows to stimulate five times more cells than conventional static illumination for the same laser power.