Vers la conception de riborégulateurs synthétiques modulant l'activité du facteur de terminaison de la transcription Rho

Towards the design of synthetic riboregulators modulating the activity of transcription termination factor Rho

• Auteur / Autrice : Isabelle Simon
• Direction : Marc Boudvillain
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 13/12/2021
• Etablissement(s) : Orléans
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (Centre-Val de Loire ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de biophysique moléculaire (Orléans ; 1967-....)
• Jury : Président / Présidente : Agnès F. Delmas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Boudvillain, Agnès F. Delmas, Konstantin Brodolin, Johannes Geiselmann, Jérôme Bonnet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Konstantin Brodolin, Johannes Geiselmann

Mots clés

Mots clés contrôlés

Terminaison de la transcription

génétique

Facteur Rho

ARN

Biologie de synthèse

Transcription génétique

Riborégulateurs

Mots clés libres

Riboswitch synthétique

Synthetic riboswitch

Résumé

La biologie synthétique est une discipline qui a pour but de concevoir des objets et des systèmes biologiques nouveaux ou de reprogrammer des systèmes biologiques naturels pour leur faire effectuer une tâche précise. Un défi majeur en biologie synthétique est d'assurer un contrôle rigoureux de l'expression de gènes et des flux métaboliques dans les cellules dédiées à la bio-production ou la thérapie. Bien que des switches inductibles régulant généralement la transcription ou la traduction aient déjà été développés, leur utilité pratique est limitée par une faible diversité d'inducteurs / stimuli adaptés et par des gammes dynamiques souvent sous-optimales. Il devient de plus en plus clair qu'un contrôle optimal exigera la mise en place de réseaux de régulation complexes imitant les réseaux multicouches existant dans la nature. Afin d’élargir le panel de composants moléculaires permettant un tel contrôle, l’objectif de cette thèse était de concevoir un riboswitch synthétique capable de contrôler la terminaison de la transcription Rho-dépendante et potentiellement « adossable » à d’autres types de riborégulateurs. Rho est un facteur protéique bactérien ATP-dépendant qui induit la terminaison de la transcription pour de nombreux gènes. J’ai développé un prototype de riboswitch Rho-dépendant en modifiant un riborégulateur naturel présent dans la partie 5’ non traduite de l’opéron pgaABCD d’E coli avec un aptamère reconnaissant la théophylline. En parallèle, j’ai caractérisé différents facteurs Rho phylodivergents dans l’espoir que certains présentent une sensibilité accentuée à la structuration de l’ARN, une propriété qui pourrait éventuellement être utilisée pour augmenter la réponse d’un riboswitch synthétique Rho-dépendant. Enfin, j’ai développé un essai fluorescent de l’activité hélicase du facteur Rho permettant un débit de caractérisation élevé en microplaques. Mes résultats renforcent notre compréhension des mécanismes de la terminaison Rho-dépendante, offrent un premier exemple de riboswitch synthétique reposant sur ce mécanisme et ouvrent des perspectives intéressantes pour un meilleur contrôle des circuits synthétiques de régulation génique.

The aim of synthetic biology is to design new biological objects and systems or to reprogram natural biological systems to perform a specific task. A major challenge in synthetic biology is to ensure the rigorous control of gene expression and metabolic fluxes in cells dedicated to bioproduction or therapy. Although regulatory switches acting at the transcriptional or translational level have been developed, their practical utility is limited by a low diversity of suitable inducers/stimuli and by suboptimal dynamic ranges. It is becoming increasingly clear that optimal control will require the development of complex regulatory circuits that mimic the multi-layered circuits found in nature. In order to broaden the panel of molecular components allowing suchcontrol, this thesis aimed to develop a synthetic riboswitch able to govern Rho-dependent transcription termination and to potentially complement other types of ribregulators. Rho is an ATP-dependent motor protein that disrupts transcription complexes throughout bacterial genomes. I have developed a prototype of Rho-dependent riboswitch by integrating a theophylline aptamer into a natural riboregulator present in the 5' leaderof the E coli pgaABCD operon. In parallel, I have characterised phylodivergent Rho factors in search of specimen(s) with increased sensitivity to RNA structure, a feature that could prove advantageous to increase the dynamic response of synthetic Rho-dependent riboswitches. Finally, I have developed a fluorescent assay to monitor the helicase activity of the Rho factor, there by allowing a high analytical throughput with a microplatereader. Altogether, this work sheds new light on the mechanisms of Rho-dependent termination, provides the first example of a synthetic Rho-dependent riboswitch, and opens interesting possibilities for the fine-tuning of complex regulatory circuits.