Αctivité chitinοlytique et prοpriétés structurales de la cuticule chez la crevette Ρalaemοn serratus : Descriptiοn au cοurs du cycle de mue et perspectives d'utilisatiοn en écοtοxicοlοgie

Chitinolytic enzyme activity and cuticle structural properties of the marine prawn Palaemon serratus : Description along the moult cycle and application perspectives in ecotoxicology

• Auteur / Autrice : Marc Rollin
• Direction : Frank Le Foll
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiologie et biologie des organismes - populations - interactions
• Date : Soutenance le 03/12/2021
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Stress environnementaux et biosurveillance des milieux aquatiques (Reims, Marne ; Le Havre, Seine-Maritime)
• Jury : Président / Présidente : Carole Cossu-Leguille
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Romain Coulaud, Vincent Felten, Céline Picard, Benoît Xuereb
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Susana de Matos Fernandes, Elliott Sucré
• DOI : 10.70675/3b2a4852zc1ebz484fzabbbzf0bc1037a6a7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Palémonidés

Crustacés

Crevettes

Mue

Mots clés libres

Palaemon serratus

Mue

N-Acétyl-B-D-Glucosaminidase

Thermogravimétrie

Crustaceans

Moult

TGA analysis

Résumé

La mue est une fonction physiologique cruciale chez les crustacés, sous la dépendance de mécanismes moléculaires complexes pouvant être la cible de polluants. Si des perturbations de la mue par l’action de xénobiotiques ont été rapportées en conditions contrôlées de laboratoire par de nombreux travaux, les méthodologies permettant de poser un diagnostic de telles perturbations in natura restent extrêmement limitées. Dans ce contexte, l’objectif de ces travaux de thèse est d’étudier des processus clés en lien avec la mue, dans une perspective de dégager quelques marqueurs candidats susceptibles de détecter des altérations de cette fonction chez la crevette marine Palaemon serratus, tant dans le cadre d’essais en laboratoire que de suivis in situ. Les investigations se sont focalisées sur i) l’activité de l’enzyme chitinolytique N-acétyl-β-D-glucosaminidase (i.e. NAGase), et ii) la mesure des propriétés physicochimiques de la cuticule, retenues car permettant de faire la jonction entre la réalisation de la régulation hormonale de la mue et la physiologie de l’organisme. La première étape de ces travaux a été consacrée à l’optimisation méthodologique et le suivi des réponses au cours du cycle de mue de P. serratusAinsi, les conditions de dosage de l’activité enzymatique de la NAGase ont été calibrées, permettant d’obtenir un protocole de lecture robuste. Les niveaux et profils d’activité NAGase mesurés au cours du cycle de mue étaient cohérents avec ceux retrouvés dans la littérature, corroborant une élévation significative de l’activité de la NAGase en fin de prémue. Ces résultats ont confirmé l’importance de fixer une même fenêtre d’observation au cours du cycle de mue chez les spécimens analysés, avec un intérêt prononcé pour le stade D2 chez les crevettes. Dans une même perspective de développement et d’optimisation d’outils, une batterie d’approches physicochimiques a été déployée pour caractériser les propriétés de la cuticule de P. serratus. Les analyses thermiques ont ainsi permis d’identifier des événements remarquables associés à l’évaporation de l’eau, la dégradation des macromolécules, de la chitine et à la volatilisation de la fraction inorganique labile. Ces analyses ont été complétées par la caractérisation de la fraction minérale par ICP-MS et une analyse du spectre infrarouge des éléments de surface obtenu par ITRF. Une description dynamique au cours du cycle de mue a permis de mettre en évidence des changements structuraux. Lors d’une seconde étape, l’activité de la NAGase et les propriétés cuticulaires ont été étudiées sous l’influence de stress chimiques dans le cadre d’expositions contrôlées. Un screening in vitro a permis de mettre en évidence des inhibitions de l’activité de la NAGase en présence d’un inhibiteur spécifique, la pentoxifylline, et de contaminants environnementaux tels que le cadmium ou le glyphosate. De même, l’altération des propriétés physicochimiques de la cuticule a été observée dans le cadre de traitement in vitro de cuticule à un stress acide. En revanche, aucun effet significatif sur l’activité de la NAGase ou l’intégrité cuticulaire n’a été observé chez des spécimens de P. serratus exposés in vivo après 21 ± 0,4 jours au cadmium et à la pentoxifylline (i.e. respectivement 0,5 et 100 µmol.L-1). En parallèle, la mesure de l’activité de la NAGase sur des crevettes présentes en différents sites du littoral de la Baie de Seine a montré des niveaux inter-sites contrastés, cohérents avec l’historique de contamination de ces sites. Si l’apparition de réponses contrastées a également été observée par analyse ATG, ces dernières étaient en opposition avec les mesures de NAGase, soulignant l’intérêt de mieux appréhender la variabilité des réponses fournies par ces méthodes innovantes. In fine, l’intérêt et le périmètre de l’utilisation, en tant que biomarqueur, des méthodes développées au cours de ce travail de thèse sont discutés au regard de l’ensemble des résultats.

Moult is a key physiological function for crustaceans, dependant from many molecular mechanisms that could be targeted by contaminants. If moult disturbances, owing to the contaminant actions, have been greatly reported in laboratory conditions, methods allowing this kind of diagnosis in natura are extremely limited. In this context, the thesis aim was to study the main mechanisms linked with moulting process, to select some interesting markers that could detect moult alterations on the marine prawn Palaemon serratus, on both laboratory and field conditions. Research have been focused on i) the activity of the chitinolytic enzyme N-acetyl-β-D-Glucosaminidase (NAGase), required to achieve moult, and ii) the analysis of physicochemical cuticle properties, linked with its structure. These mechanisms have been observed since their responses may linked the moult molecular regulation and the organism physiology. The first step of this study consisted of the methodological optimisation and the analysis of the selected moult responses along the moult cycle of P. serratus, as well as for Gammarus fossarum, freshwater crustacean regularly used in ecotoxicology. To do this, enzymatic activity measurement has been calibrated, defining a robust measuring protocol. Levels and dynamics of NAGase activity along the moult cycle were similar with other crustaceans, highlighting an increase of activity during the late premoult. Contrary to moult cycle, no sex influence was observed on NAGase activity. These results confirmed the need to define a specific moult period to analyse the response of markers, particularly in D2 and D1 stages for prawn and gammarid NAGase activities respectively. In a same way, several physicochemical approaches were used to characterise P. serratus cuticle properties. Thermal analyses allowed to identify specific events linked with bound water evaporation, protein, and chitin degradations, as well as inorganic salt volatilisation. These analyses have been completed with the ICP-MS mineral fraction characterisation and the cuticle surface composition performed by FTIR measurements. A dynamical study of cuticle properties along the moult cycle revealed some major structure changes. Such changes were consistent with the cuticle rigidification process occurring at postmoult. Among parameters measured, these obtained by both TGA and ICP-MS mineral analyses were the most relevant to characterise cuticle structure modifications. In a second step, NAGase activity and cuticle property markers were assessed in controlled exposure approaches. Hence, in vitro screening showed NAGase inhibitions led by a specific inhibition, pentoxifylline, as well as by cadmium or glyphosate. Similarly, cuticle property alterations were detected following a formic acid exposure of P. serratus cuticle. However, after an in vivo exposure of prawns to cadmium and pentoxifylline (at 0.5 and 100 µmol.L-1 respectively) during 21 ± 0,4 days, no alterations were found based on moult marker analyses. Besides, despite the observation of moult delays, no impact was detected on NAGase activity of gammarids exposed to ex situ STEP effluent concentrations. In parallel, the NAGase activity assessment on prawns collected on different sites along the Baie de Seine coastline revealed differences in activity, which were consistent with the contamination degree found in these sites. Such differences were also observed with TGA analyses, but not in agreement with the contamination degree, highlighting the need to better know the response variability of this marker, through both natural and pollutant influences. Finally, interest and use setting of the selected markers as potential biomarkers were discussed according to all the results obtained during this work.