Etude protéomique et impact de la modulation de la voie de la Calmoduline/Calcineurine chez Candida glabrata résistant à la caspofungine

Proteomic study and impact of the modulation of the Calmodulin/Calcineurin pathway in Caspofungin-resistant Candida glabrata isolates

Estudio proteómico y efecto de la modulación de la vía Calmodulina/Calcineurina en aislamientos de Candida glabrata resistentes a caspofungina

• Auteur / Autrice : Carlos Andres Ceballos Garzón
• Direction : Patrice Le Pape, Claudia Marcela Parra Giraldo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 08/02/2021
• Etablissement(s) : Nantes en cotutelle avec Pontificia universidad javeriana (Bogotá)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cibles et Médicaments de l'Infection, de l'Immunité (Nantes)
• Jury : Président / Présidente : Pascal Marchand
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Angel Gonzalez Marin, Nidia Fernanda Alvarez Rueda
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rebeca Alonso Monge, Julian Esteban Muñoz Henao

Mots clés

Mots clés contrôlés

Calcineurine

Caspofungine

Candida glabrata

Résistance aux antifongiques

Mots clés libres

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Résumé

Malgré la prévalence des infections fongiques, le nombre de médicaments antifongiques reste faible et l'apparition de résistance augmente. Le principal défi thérapeutique réside dans l'obtention de molécules à sélectivité fongique. Par conséquent, il est nécessaire de développer de nouveaux antifongiques avec des mécanismes d'action nouveaux et/ou développer des médicaments qui en association améliorent l'activité des antifongiques actuels. Dans ce travail, le premier objectif visait l'identification des mécanismes de résistance aux échinocandines par séquençage de l'ensemble du génome des isolats cliniques de Candida glabrata. Puis des études protéomiques de la réponse à l'exposition à la caspofungine ont été menées. Enfin, l'analyse de l'impact des inhibiteurs et mutants de la voie de la calcineurine sur la sensibilité, la tolérance au stress, la formation de biofilm et la pathogénicité a été réalisée. Le séquençage total des isolats résistant à la caspofungine n’a montré qu’une seule délétion au niveau du gène FKS. Pour déchiffrer le profil protéomique de C. glabrata en réponse à l'exposition à la caspofungine, l'extraction et l'identification des protéines ont été effectuées. Vingt et une protéines ont vu leur abondance changer ; certaines de ces protéines sont impliquées dans la biosynthèse de la paroi cellulaire, la pathogenèse et la réponse au stress. De plus, certaines d'entre elles sont des constituants de la voie CaM/Cal, comme par exemple le facteur de transcription Crz1. Ces résultats ont été corroborés en utilisant des inhibiteurs de la voie CaM/Cal et des mutants Crz1Δ. En effet leur utilisation a permis de restaurer le phénotype de sensibilité et à diminuer la capacité à répondre aux conditions de stress et la pathogénicité. Les inhibiteurs protéiques de la voie CaM/Cal, comme le facteur de transcription Crz1, pourraient être une excellente option thérapeutique, sur la base des résultats obtenus dans des modèles in vitro et in vivo. Ces résultats pourraient potentiellement être utilisés pour améliorer les thérapies des infections fongiques, sachant que la résistance aux antifongiques est en forte augmentation.

Despite the prevalence of fungal infections, few novel antifungals have been introduced in recent years and the emergence of resistance is increasing. The therapeutic challenge lies in achieving fungal selectivity. Therefore, to improve clinical outcomes, it will be necessary to develop new antifungals with different mechanisms of action and/or to discover drugs that improve the activity of current antifungals. In this work, the first objective was to identify resistant mechanisms by whole genome sequencing in echinocandinresistant C. glabrata isolates. Then, studies of the proteomic response to caspofungin exposure and the analysis of the impact of calcineurin inhibitors and Crz1Δ mutants on susceptibility, stress tolerance, biofilm formation, and pathogenicity in Galleria mellonella, were conducted. After evaluating several genes related to antifungal growth, we found that the strains only harboring the mutation in the FKS2 (F659-Del) gene. In order to decipher the proteomic profile of C. glabrata in the response to caspofungin exposure, protein extraction was carried out. We identified 21 proteins whose abundance changed, some of these proteins are involved in wall biosynthesis, pathogenesis, and response to stress, and some of them are members of the CaM/Cal pathway, such as the transcriptional factor Crz1. We corroborated these results by using CaM/Cal inhibitors and Crz1Δ mutants, where we achieve to return the susceptibility and to decrease the capacity to respond to stress conditions and pathogenicity. Protein inhibitors of the CaM/Cal pathway, such as the transcription factor Crz1, could be an excellent therapeutic option, based on the results obtained and tested in vitro and in vivo models. Results, which could potentially be used to improve therapies in fungal infections, especially now that antifungal resistance is rising.

A pesar de la prevalencia de las infecciones fúngicas, el número de antifúngicos es reducido y la aparición de resistencia es creciente. El principal desafío terapéutico radica en lograr la selectividad fúngica. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos antifúngicos con diferentes mecanismos de acción y/o desarrollar fármacos que mejoren la actividad de los antifúngicos actuales. En este trabajo, el primer objetivo se basó en la identificación de mecanismos de resistencia a candinas mediante la secuenciación del genoma completo en aislamientos clínicos de C. glabrata. Luego, se realizaron estudios proteómicos de la respuesta de crecimiento frete a la exposición a caspofungina, seguido del análisis del impacto de inhibidores y mutantes de la vía calcineurina en la susceptibilidad, tolerancia a estrés, formación de biopelículas y patogenicidad en Galleria mellonella. Después de evaluar los genes relacionados con el crecimiento antifúngico, encontramos que las cepas solo presentaron mutación en el gen FKS2. Para descifrar el perfil proteómico de C. glabrata en respuesta a la exposición a caspofungina, se realizó extracción e identificación de proteínas. Identificamos 21 proteínas cuya abundancia cambió, algunas de las proteínas están involucradas en la biosíntesis de la pared celular, patogénesis y respuesta al estrés. Además, algunas de estas son miembros de la vía CaM/Cal, como el factor transcripcional Crz1. Corroboramos estos resultados utilizando inhibidores de CaM/Cal y mutantes Crz1Δ, en donde logramos retornar el fenotipo de susceptibilidad y disminuir la capacidad de respuesta a condiciones de estrés y patogenicidad. Los inhibidores de proteínas de la vía CaM/Cal, como el factor de transcripción Crz1 podrían ser una excelente opción terapéutica, basados en los resultados obtenidos y probados en modelos in vitro e in vivo. Resultados, que podrían usarse potencialmente para mejorar las terapias en las infecciones fúngicas, especialmente ahora que la resistencia a los antifúngicos está en aumento.