Structure et assemblage des pores nucléaires par microscopie corrélative AFM et de super-résolution
Auteur / Autrice : | Anthony Vial |
Direction : | Pierre-Emmanuel Milhiet |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Biologie Santé |
Date : | Soutenance le 09/12/2021 |
Etablissement(s) : | Montpellier |
Ecole(s) doctorale(s) : | Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : Centre de Biologie Structurale (Montpellier) |
Jury : | Président / Présidente : Csilla Gergely |
Examinateurs / Examinatrices : Pierre-Emmanuel Milhiet, Csilla Gergely, Victor Shahin, Félix Rico, Shotaro Otsuka, Christine Doucet | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Victor Shahin, Félix Rico |
Mots clés
Mots clés contrôlés
Résumé
Les pores nucléaires (NPC) sont les seules passerelles entre le noyau et le cytoplasme. Ils sont constitués de plusieurs copies d'une trentaine de protéines appelées nucléoporines. Pendant l'interphase, les cellules en prolifération doivent dupliquer leur matériel génétique, organelles, membranes et outils enzymatiques, pour les répartir entre les cellules filles. Dans la plupart des cas, il s'agit simplement d'une question de synthèse de protéines et de lipides, or la réplication du NPC est un processus complexe impliquant un assemblage macromoléculaire combiné à un remodelage membranaire. De plus, la barrière de perméabilité nucléaire doit rester intacte pendant tout le processus, ce qui souligne que l'assemblage des protéines et la fusion des membranes doivent être étroitement coordonnés. L'assemblage des pores en interphase se produit par l'insertion de novo de nouveaux pores dans l’EN, ce qui nécessite la fusion locale des membranes nucléaires interne et externe. Le processus de fusion doit impliquer l'apposition étroite des deux membranes, générant localement une combinaison complexe de courbures positive et négative dans les bicouches.Une étude récente a montré que l'assemblage du NPC en interphase est un processus directionnel qui commence au niveau de la membrane nucléaire interne. Le fait qu'un complexe protéique hautement symétrique s'assemble de manière asymétrique est extrêmement intriguant. Nous avons voulu comprendre l'évolution précise de la structure protéique et de la topographie de la membrane au cours de ce processus. Dans ce contexte, le but de ma thèse était d'étudier la séquence détaillée des événements d’assemblage du NPC au niveau moléculaire et topographique. La microscopie à force atomique (AFM) est une technique de choix pour cela, car elle produit des images topographiques à haute résolution d’objets nanoscopiques. De plus, la corrélation avec la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) peut ajouter des informations sur la composition, avec une résolution similaire. L'AFM étant une technique nécessitant d’entrer en contact avec l’échantillon, j'ai d'abord dû mettre au point un protocole pour purifier et ouvrir les noyaux de cellules humaines d'une manière qui n'affecte pas la structure des NPCs et de l’EN autour. Ensuite, j'ai mesuré pour la première fois la topographie et les propriétés mécaniques de la face nucléoplasmique de NPCs humains, ainsi que des images SMLM du composant principal du panier, Tpr. Mes résultats démontrent une large gamme de flexibilité dans les conformations de cette structure, ce qui remet en question la structure protubérante du panier habituellement admise.Ensuite, j'ai utilisé l'immunomarquage différentiel pour discriminer les NPCs matures des intermédiaires, et enregistrer leur topographie. De plus, le SMLM sur POM121, un acteur précoce de l'assemblage en interphase, a révélé que cette nucléoporine transmembranaire agit comme un point d'ancrage dans les intermédiaires précoces. La concentration de POM121 augmente ensuite à ce point d'ancrage et croît, pour finalement être ségrégée vers une structure en anneau dans les intermédiaires de l'interphase du NPC.Enfin, en utilisant des mesures quantitatives de la structure des NPC basées sur la microscopie à déplétion par émission stimulée, combinées à des traitements par ARN interférent contre un ensemble de nucléoporines, j'ai pu caractériser la contribution de plusieurs nucléoporines à la cinétique d'assemblage et à la structure en interphase des intermédiaires de NPCs.Pris ensemble, ces résultats ont démontré comment l'AFM peut être utilisé comme un nano-outil pour étudier la membrane nucléaire interne des cellules humaines et en particulier des NPCs. Ils révèlent également la grande variabilité de la structure du panier des NPC et apportent de nouvelles informations pour comprendre l'assemblage en l'interphase des NPC.