Structure et assemblage des pores nucléaires par microscopie corrélative AFM et de super-résolution

Structure and assembly of nuclear pore complexes by correlative AFM and super-resolution microscopy

• Auteur / Autrice : Anthony Vial
• Direction : Pierre-Emmanuel Milhiet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 09/12/2021
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Biologie Structurale (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Csilla Gergely
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre-Emmanuel Milhiet, Csilla Gergely, Victor Shahin, Félix Rico, Shotaro Otsuka, Christine Doucet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Victor Shahin, Félix Rico

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie à super-résolution

Membrane cellulaire

Pores nucléaires

Mots clés libres

Afm

Pore nucléaire

Courbure membranaire

Microscopie de super-Résolution

Afm

Nuclear pore complex

Membrane curvature

Super-Resolution microscopy

Résumé

Les pores nucléaires (NPC) sont les seules passerelles entre le noyau et le cytoplasme. Ils sont constitués de plusieurs copies d'une trentaine de protéines appelées nucléoporines. Pendant l'interphase, les cellules en prolifération doivent dupliquer leur matériel génétique, organelles, membranes et outils enzymatiques, pour les répartir entre les cellules filles. Dans la plupart des cas, il s'agit simplement d'une question de synthèse de protéines et de lipides, or la réplication du NPC est un processus complexe impliquant un assemblage macromoléculaire combiné à un remodelage membranaire. De plus, la barrière de perméabilité nucléaire doit rester intacte pendant tout le processus, ce qui souligne que l'assemblage des protéines et la fusion des membranes doivent être étroitement coordonnés. L'assemblage des pores en interphase se produit par l'insertion de novo de nouveaux pores dans l’EN, ce qui nécessite la fusion locale des membranes nucléaires interne et externe. Le processus de fusion doit impliquer l'apposition étroite des deux membranes, générant localement une combinaison complexe de courbures positive et négative dans les bicouches.Une étude récente a montré que l'assemblage du NPC en interphase est un processus directionnel qui commence au niveau de la membrane nucléaire interne. Le fait qu'un complexe protéique hautement symétrique s'assemble de manière asymétrique est extrêmement intriguant. Nous avons voulu comprendre l'évolution précise de la structure protéique et de la topographie de la membrane au cours de ce processus. Dans ce contexte, le but de ma thèse était d'étudier la séquence détaillée des événements d’assemblage du NPC au niveau moléculaire et topographique. La microscopie à force atomique (AFM) est une technique de choix pour cela, car elle produit des images topographiques à haute résolution d’objets nanoscopiques. De plus, la corrélation avec la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) peut ajouter des informations sur la composition, avec une résolution similaire. L'AFM étant une technique nécessitant d’entrer en contact avec l’échantillon, j'ai d'abord dû mettre au point un protocole pour purifier et ouvrir les noyaux de cellules humaines d'une manière qui n'affecte pas la structure des NPCs et de l’EN autour. Ensuite, j'ai mesuré pour la première fois la topographie et les propriétés mécaniques de la face nucléoplasmique de NPCs humains, ainsi que des images SMLM du composant principal du panier, Tpr. Mes résultats démontrent une large gamme de flexibilité dans les conformations de cette structure, ce qui remet en question la structure protubérante du panier habituellement admise.Ensuite, j'ai utilisé l'immunomarquage différentiel pour discriminer les NPCs matures des intermédiaires, et enregistrer leur topographie. De plus, le SMLM sur POM121, un acteur précoce de l'assemblage en interphase, a révélé que cette nucléoporine transmembranaire agit comme un point d'ancrage dans les intermédiaires précoces. La concentration de POM121 augmente ensuite à ce point d'ancrage et croît, pour finalement être ségrégée vers une structure en anneau dans les intermédiaires de l'interphase du NPC.Enfin, en utilisant des mesures quantitatives de la structure des NPC basées sur la microscopie à déplétion par émission stimulée, combinées à des traitements par ARN interférent contre un ensemble de nucléoporines, j'ai pu caractériser la contribution de plusieurs nucléoporines à la cinétique d'assemblage et à la structure en interphase des intermédiaires de NPCs.Pris ensemble, ces résultats ont démontré comment l'AFM peut être utilisé comme un nano-outil pour étudier la membrane nucléaire interne des cellules humaines et en particulier des NPCs. Ils révèlent également la grande variabilité de la structure du panier des NPC et apportent de nouvelles informations pour comprendre l'assemblage en l'interphase des NPC.

A characteristic feature of eukaryotic cells is the physical isolation of the genetic material by the nuclear envelope (NE), a double lipid bilayer composed of an inner and outer nuclear membrane separated by a lumen. Across this barrier are the nuclear pore complexes (NPCs), the only gateways between the nucleus and cytoplasm. They are made of multiple copies of around 30 proteins called nucleoporins. During interphase, proliferating cells have to duplicate their genetic material, organelles, membranes and enzymatic tools, to split them between daughter cells. While DNA replication is widely studied, duplication of other materials is largely unexplored. In most cases, this is just a matter of protein and lipid synthesis, yet NPC replication is a complex process involving macromolecular assembly combined with membrane remodelling. Moreover, the nuclear permeability barrier must remain intact during the whole process, underlining that protein assembly and membrane fusion must be tightly coordinated. Interphase pore assembly occurs by de novo insertion of new pore units in the NE, which requires the local fusion of the inner and outer nuclear membranes. The fusion process must involve the close apposition of the two membranes, generating locally a complex combination of positive and negative curvature in the bilayers.A recent study showed that interphase assembly of the NPC is a directional process that initiates at the inner nuclear membrane. That a highly symmetrical protein complex assembles in an asymmetric manner is extremely intriguing. We wanted to elucidate the precise evolution of the protein structure and membrane topography during this process. In this context, the goal of my thesis was to investigate the detailed sequence of events of NPC assembly at the molecular and topographic level. Atomic Force Microscopy (AFM) is a technique of choice for this, as it produces high-resolution topographies from single nano-objects. Moreover, correlative Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) can add compositional information, with a similar resolution. As AFM is a contact technique, I first had to develop a protocol to purify and open human cell nuclei in a manner that does not affect the structure of NPCs and surrounding NE. Then I measured for the first time the topography and mechanical properties of human NPC nucleoplasmic side, together with SMLM images of the main basket component Tpr. My results demonstrate a large range of flexibility in the conformations of this structure which questioned the usually admitted protruding structure of the basket.Then, I used differential immuno-labelling to discriminate mature NPCs from intermediates, and record their topography. In addition, SMLM on POM121, an early player in interphase assembly, revealed that this transmembrane nucleoporin acts as a seeding point in early intermediates. POM121 concentration then increases at this seeding point and grows, to finally be segregated towards a ring structure in NPC interphase intermediates.Finally, using quantitative measurements of NPC structure based on Stimulated Emission Depletion Microscopy combined with small-interferent RNA treatments against a set of nucleoporins, I have been able to characterize the contribution of several nucleoporins to the kinetics of assembly and structure of NPC interphase intermediates.Taken together, these results demonstrated how AFM can be used as a nanotool to investigate the inner nuclear membrane of human cells and especially NPCs. They also reveal the high variability of NPC basket structure and bring new information to understand the complex process of NPC interphase assembly.