Étude de l'architecture des gènes cibles de Polycomb chez la Drosophile en utilisant la microscopie optique multiplexée

Study of Polycomb target genes architecture in Drosophila using multiplexed optical microscopy

• Auteur / Autrice : Julián Roberto Gurgo
• Direction : Marcelo Nollmann, Frédéric Bantignies
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 08/12/2021
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Biologie Structurale (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Cédric Vaillant
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marcelo Nollmann, Frédéric Bantignies, Cédric Vaillant, Chiara Lanzuolo, Reini Luco, Guillermo A. Orsi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Cédric Vaillant

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcription génétique

Protéines Polycomb

Régulation génétique

Chromatine

Mots clés libres

Multiplexed FISH

Organisation 3D de la chromatine

Protéines du groupe Polycomb

Régulation génique

Multiplexed FISH

Chromatin 3D organization

Polycomb group proteins

Gene regulation

Résumé

L’organisation de la chromatine est liée à de nombreux processus biologiques. Les techniques de capture de conformation des chromosomes ont révélé que la chromatine est organisée en domaines enrichis en interactions chromatiniennes, appelés Topologi-cally Associating Domains (TADs). Chez la drosophile, les TADs coïncident avec les marques chromatiniennes actives et réprimées, et sont classés en fonction de leurs états épigénétiques. L’un de ces types de TAD, connu sous le nom de TADs Polycomb, est lié aux protéines du groupe Polycomb (protéines PcG), une famille de facteurs conservés dans la plupart des organismes eucaryotes, et cruciaux pour la régulation de la répression des gènes. Des preuves issues de la microscopie et des techniques de capture de la conformation des chromosomes montrent que les cibles PcG ont tendance à interagir préférentiellement les unes avec les autres, ce qui suggère qu’elles forment des compartiments de répression. Cependant, on sait peu de choses sur la nature de ces interactions, ou si plusieurs gènes PcG sont associés en 3D pour former des compartiments. Dans ce travail, nous étudions le rôle des protéines du groupe Polycomb dans la formation de compartiments répressifs au cours du développement de la drosophile en appliquant Hi-M, une nouvelle méthode basée sur l’imagerie qui permet la reconstruction de la conformation de la chromatine tout en préservant l’information spatiale. Nous avons d’abord étendu Hi-M pour permettre l’imagerie d’échantillons épais et multicouches en combinant un robot de manipulation fluidique à un microscope confocal et en adaptant les pipelines d’analyse existants. Ensuite, nous avons appliqué cette méthode pour étudie rl’organisation chromosomique des gènes cibles de Polycomb dans différents segments d’une mbryon de drosophile en développement. Nous montrons que la co-localisation spatiale de cibles Polycomb intra-chromosomiques distantes est peu fréquente, et que ces inter-actions sont principalement par paires. Nous observons également que les interactions à longue portée sont acquises après l’émergence des TADs à NC14, de façon concomitante avec l’enrichissement des foyers de PcG. Ces résultats ont été soutenus par la modélisation du polymère montrant qu’un polymère séparé en microphase dans le régime des globules capture le comportement expérimental des domaines Polycomb. Nos expériences et simulations suggèrent que les compartiments répressifs Polycomb se forment par des associations par paires peu fréquentes de domaines Polycomb. Enfin, nous montrons que les fréquences d’interaction entre les cibles Polycomb sont modulées à la fois par la répression et l’activation transcriptionnelle. Dans l’ensemble, nos résultats éclairent l’organisation des gènes cibles de Pc à l’échelle du chromosome, et contraignent les futurs modèles de formation des compartiments de Pc.

Chromatin organization is related to many biological processes. Chromosome confor-mation capture techniques revealed that chromatin is organized in domains enriched inchromatin interactions, called Topologically Associating Domains (TADs). In Drosophila,TADs coincide with active and repressed chromatin marks, and are classified according totheir epigenetic states. One of these TAD types, known as Polycomb TADs, are bound byPolycomb group proteins (PcG proteins), a family of factors conserved in most eukaryoticorganisms, and crucial for the regulation of gene repression. Evidence from microscopyand chromosome conformation capture techniques shows that PcG targets tend to pref-erentially interact with each other, suggesting that they form repressive compartments.However, little is known about the nature of these interactions, or if several PcG genesare associated in 3D to form compartments.In this work, we investigate the role of Polycomb group proteins in the formationof repressive compartments during Drosophila development by applying Hi-M, a novelimaging-based method that enables the reconstruction of chromatin conformation whilepreserving spatial information. We first extended Hi-M to enable imaging of thick,multi-layered samples by combining a fluidics handling robot to a confocal microscopeand adapting existing analysis pipelines. Next, we applied this method to the studythe chromosome-wide organization of Polycomb target genes in different segments of adeveloping Drosophila embryo. We show that spatial co-localization of distant intra-chromosomal Polycomb targets is infrequent, and that these interactions are predom-inantly pairwise. We also observe that long-range interactions are acquired after theemergence of TADs at NC14, concomitantly with the enrichment of PcG foci. These re-sults were supported by polymer modelling showing that a microphase-separated polymerin the globule regime captures the experimental behaviour of Polycomb domains. Ourexperiments and simulations suggest that Polycomb repressive compartments form byinfrequent pairwise associations of Polycomb domains. Finally, we show that interactionfrequencies between Polycomb targets are modulated by both transcriptional repressionand activation. Overall our results shed light into the chromosome-wide organization ofPc target genes, and constrain future models for the formation of Pc compartments.