Développement de nouvelles approches de microscopie correlative AFM-Fluorescence pour l'analyse d'échantillons biologiques

Development of novel correlative AFM-Fluorescent methods for the study of biological samples

• Auteur / Autrice : Oscar Saavedra Villanueva
• Direction : Pierre-Emmanuel Milhiet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 03/05/2021
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Biologie Structurale (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Gladys Massiera
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre-Emmanuel Milhiet, Gladys Massiera, Pieter De Beule, Eric Lesniewska, Luca Costa, Lorena Redondo-Morata
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pieter De Beule, Eric Lesniewska

Mots clés

Mots clés contrôlés

Membrane cellulaire

Microscopie à force atomique

Membranes (biologie)

Mots clés libres

Membranes biologiques

Microscopie à force atomique

Miet

Microscopies corrélatives

Compression

Forces de rupture

Biological membranes

Atomic Force Microscopy (AFM)

Metal Induced Energy Transfer (MIET)

Correlative microscopies

Compression

Rupture forces

Résumé

Les membranes biologiques sont des barrières flexibles qui assurent la perméabilité des cellules, délimitant les frontières cellulaires et les compartiments intracellulaires aux organites à l'intérieur de la cellule. Elles sont composées principalement de phospholipides et de protéines. Ces composants sont les principaux responsables du remodelage des membranes. Ce dernier processus est très dynamique et nécessite une observation à haute résolution latérale et temporelle. Ce travail de thèse s'est concentré sur deux défis principaux dans l'étude des membranes : i) Les propriétés mécaniques. Les membranes sont des matériaux très mous et fragiles, et déterminer leur morphologie réelle est très compliqué en raison de leur mollesse. Nous avons étudié la force maximale exercée par une pointe AFM que les bicouches lipidiques supportées peuvent supporter avant la rupture, ainsi que leur module d'Young, tous deux en fonction de la taille de la pointe. ii) Sensibilité chimique lors de l'imagerie des membranes. L'AFM permet d'obtenir la topographie de la membrane. Cependant, cette technique ne peut pas distinguer la molécule située sous la pointe de l'AFM. Afin de surmonter cet obstacle, nous avons travaillé à la mise au point d'une nouvelle technique de fluorescence à super-résolution combinant l'AFM et les microscopies confocales. Tout d'abord, nous avons mis au point un microscope confocal synchrone et corrélé d'imagerie de fluorescence à vie (FLIM)-AFM. Enfin, nous avons mis au point un dispositif de transfert d'énergie induit par les métaux (MIET)-AFM afin de mesurer simultanément la reconnaissance moléculaire, la topographie et les propriétés mécaniques des échantillons biologiques.

Biological membranes are flexibles barriers that ensure cell permeability, delineating the cell boundaries and the intracellular compartments to organelles within the cell. They are composed mainly by phospholipids and proteins. Those components are the main ones responsible for membrane remodeling. The latter process is highly dynamic and requires observation at high spatial and temporal resolution. This thesis work focused on two main challenges in the study of membranes: i) Softness of biological membranes and their mechanical properties. Membranes are very soft and fragile materials, and determine their real morphology is highly complicated due to their softness. We have studied the maximal force exerted by an AFM tip that supported lipid bilayers can withstand before rupture, as well as their Young’s modulus, both as a function of the tip size. ii) Chemical sensitivity and molecular recognition in microscopy. AFM can achieve the topography of the membrane. However, this technique cannot distinguish the molecule below the AFM tip. In order to overcome this barrier, we worked on developing a new fluorescence super-resolution technique combining AFM and confocal microscopies. First, we developed a correlated and synchronous confocal Fluorescence-lifetime imaging microscope (FLIM)-AFM setup. Finally, we developed a Metal Induced Energy Transfer (MIET)-AFM setup in order to measure molecular recognition, topography, and mechanical properties of biological samples simultaneously.