Etude structurelle en Microscopie Confocale Raman du cartilage produit par ingénierie tissulaire

par Jean N'dre

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Frederic Cuisinier.


  • Résumé

    Le cartilage articulaire est un tissu conjonctif, non innervé et non vascularisé, qui recouvre les extrémités des os au sein des articulations. Les fortes contraintes auxquelles est soumis le cartilage provoquent souvent l’altération de la matrice articulaire. Les défauts du cartilage articulaire sont généralement associés à la douleur et à une perte de la mobilité articulaire, et ont un impact sur la qualité de la vie, y compris le bien-être physique, social et économique. En raison du défaut de régénération ou de cicatrisation spontanée du cartilage, le recours à des techniques d’ingénierie tissulaire semble une voie prometteuse pour répondre aux besoins clinques des patients souffrant d’arthrose et de troubles de l’articulation temporo-mandibulaire (TATM). Pour optimiser l’ingénierie du tissu cartilagineux, des techniques (nanométriques) non invasives, non destructives et à haute résolution sont nécessaires, afin d’évaluer la qualité et l’arrangement structurel du cartilage fabriqué in vitro. L’objectif de notre étude était de suivre la maturation du cartilage artificiel sous charges mécaniques avec des méthodes innovantes de microscopies, dont la microscopie confocale Raman, une technique d’analyse sans contact, non destructive et sans aucune préparation de l’échantillon. Nous avons, à partir des spectres et des images hyperspectrales Raman, caractériser les différences morphologiques des chondrons suivant les différentes zones de la matrice du cartilage et établir une cartographie représentative de la distribution spatiale des composants biochimiques de ladite matrice sur toute sa profondeur. Le calcul de l’épaisseur de la matrice péricellulaire a mise en évidence des variations croissantes dépendantes de la profondeur (zone superficielle est = 2,7±0,8, zone intermédiaire = 3,6±1,1et la zone profonde = 4,9±1,8, p<0,001). Sur la base des données spectrales Raman, il a été possible de suivre en temps réel les mécanismes sous-jacents au développement de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire, notamment la dédifférenciation des chondrocytes et les cellules souches mésenchymateuses (CSM) différenciées en chondrocytes. Les résultats ont été comparés à des tests immunohistologiques et de réaction en chaine polymérase (RT-qPCR). En comparant le cartilage dégradé versus le cartilage normal, il a été possible de caractériser les modifications subtiles de la structure moléculaire du tissu cartilagineux précédant les modifications morphologiques de la matrice dans l’arthrose. Ces résultats montrent à la fois la capacité et la sensibilité de la microscopie confocale Raman a caractérisé la structure du cartilage articulaire et fournit des informations précieuses pouvant servir de base dans la conception de tissus cartilagineux par ingénierie tissulaire et un outil diagnostic pour détecter de façon précoce les modifications subcellulaires liées à l’arthrose.

  • Titre traduit

    Structural study in Confocal Raman Microscopy of cartilage produced by tissue engineering


  • Résumé

    Articular cartilage is connective tissue, non-innervated and non-vascularized, that covers the ends of the bones within the joints. The high stresses to which the cartilage is subjected often lead to the alteration of the articular matrix. Defects in articular cartilage are generally associated with pain and loss of joint mobility, and have an impact on quality of life, including physical, social and economic well-being. Due to the lack of spontaneous regeneration or healing of cartilage, the use of tissue engineering techniques appears to be a promising avenue to address the clinical needs of patients with osteoarthritis and temporomandibular joint disorders (TMD). To optimize cartilage tissue engineering, non-invasive, non-destructive, high-resolution (nanometric) techniques are needed to evaluate the quality and structural arrangement of cartilage manufactured in vitro. The objective of our study was to follow the maturation of artificial cartilage under mechanical loads with innovative microscopy methods, including confocal Raman microscopy, a non-contact, non-destructive analysis technique without any sample preparation. Using Raman spectra and hyperspectral images, we have been able to characterize the morphological differences of the chondrons according to the different zones of the cartilage matrix and to establish a representative mapping of the spatial distribution of the biochemical components of the said matrix over its entire depth. Calculation of the thickness of the pericellular matrix revealed increasing depth-dependent variations (superficial zone is = 2.7±0.8, intermediate zone = 3.6±1.1 and deep zone = 4.9±1.8, p<0.001). On the basis of Raman spectral data, it was possible to follow in real time the mechanisms underlying the development of cartilage tissue by tissue engineering, in particular the dedifferentiation of chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) differentiated into chondrocytes. The results were compared to immunohistological and polymerase chain reaction (RT-qPCR) assays. By comparing degraded cartilage versus normal cartilage, it was possible to characterize the subtle changes in the molecular structure of cartilage tissue preceding the morphological changes of the matrix in osteoarthritis. These results show both the ability and sensitivity of confocal Raman microscopy to characterize the structure of articular cartilage and provide valuable information that can be used as a basis for tissue-engineered cartilage tissue design and a diagnostic tool for early detection of subcellular changes related to osteoarthritis.


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