Vers de nouvelles connaissances sur la diversité et la fonction des effecteurs TALE de Xanthomonas phaseoli pv. manihotis, l'agent causal de la brûlure bactérienne du manioc

New insights into the diversity and function of Transcription Activator-Like effectors of Xanthomonas phaseoli pv. manihotis, the causal agent of Cassava Bacterial Blight

• Auteur / Autrice : Carlos Andrés Zarate Chaves
• Direction : Boris Szurek, Adriana Bernal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Mécanismes des interactions parasitaires pathogènes et symbiotiques
• Date : Soutenance le 16/07/2021
• Etablissement(s) : Montpellier
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale GAIA Biodiversité, agriculture, alimentation, environnement, terre, eau (Montpellier ; 2015-...)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Plant Health Institute (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : Alia Dellagi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Boris Szurek, Adriana Bernal, Alia Dellagi, Laurent Noël, Barbara De Coninck, Ricardo Oliva
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Alia Dellagi, Laurent Noël

Mots clés

Mots clés contrôlés

Manioc

Effecteurs de type activateur de transcription

Xanthomonas

Mots clés libres

TranscriptActivator-Like Effector

Xanthomonas

Gènes de sensibilité

Manioc

CRISPRi

Sweet

Transcription Activator-Like Effectors

Xanthomonas

Susceptibility genes

Cassava

CRISPRi

Sweet

Résumé

Le manioc (Manihot esculenta Crantz) nourrit environ 800 millions de personnes et soutient l'économie des agriculteurs à faible revenu sous les tropiques. Les stress biotiques notamment causés par des virus et bactéries sont responsables d’importantes pertes économiques. Xanthomonas phaseoli pv. manihotis (Xpm) est l’agent causal de la bactériose vasculaire du manioc (CBB) qui est une des bactérioses les plus dévastatrices de cette culture. La CBB est une maladie vasculaire et systémique pouvant entrainer de fortes pertes de rendement. Xpm dépend notamment de ses effecteurs de type III pour contourner l'immunité des plantes et coloniser les tissus de l’hôte. Ces effecteurs comprennent les Xanthomonas outer proteins et les Transcription Activator-Like effectors (TALE) qui agissent comme de véritables facteurs de transcription eucaryotes. Une fois injectés dans la cellule cible, les TALE migrent vers le noyau de l'hôte et ciblent des motifs d'ADN spécifiques (effector binding element, EBE) via des motifs répétés situés dans la région centrale de la protéine. Une fois fixé sur le promoteur du gène cible, les TALE interagit avec les facteurs de transcription de l'hôte via sa région C-terminale, recrutant ainsi l'ARN polymérase de type II pour initier la transcription du gène. Les TALE jouent un rôle clé dans la pathogenèse de Xpm, notamment via l'activation transcriptionnelle de gènes de susceptibilité (S) tels que le gène MeSWEET10a qui code pour un transporteur de sucrose. S’il est connu que TAL20Xam668 et TAL14Xam668 et leurs homologues sont des facteurs de virulence majeurs de Xpm car favorisent le le développement de lésions aqueuses et la croissance bactérienne in planta, on connaît mal la diversité des TALE parmi les populations de Xpm, la distribution des TALE de virulence majeurs, et les autres déterminants de la maladie. Dans cette thèse, nous avons traité ces questions selon trois chapitres : i) diversité et fonction des TALEs, ii) gènes S alternatifs, et iiii) développement d’un outil de type CRISPRi pour éteindre l’expression des TALE chez Xanthomonas. L'étude de la diversité et de la fonction des TALEs a révélé 13 nouveaux variants chez Xpm, dont un avec 22 répétitions qui active MeSWEET10a. De plus, nous avons identifié deux cas potentiels de convergence fonctionnelle. La pertinence de ces résultats réside dans la description de nouveaux variants de TALE majeurs et de « hubs » de sensibilité potentiels. L'étude des gènes S alternatifs a conduit à l'identification de MeSWEET10e qui code un nouveau transporteur de sucre SWEET manipulé par Xpm. MeSWEET10e semble toutefois induit indirectement par des variants de TALE15 mais le mécanisme reste à découvrir. Ces résultats sont utiles pour la génération de variétés de manioc durablement résistantes à Xpm. Enfin, ayant rencontré des difficultés pour muter les TALE dans certaines souches de Xpm, nous avons mis en place une plateforme d’extinction de l’expression génique basée sur la technologie CRISPRi, qui pourrait être extrapolée à d'autres familles de gènes et à d'autres espèces de Xanthomonas. Trois ARN guides (sgRNA) ont été conçus pour éteindre les TALE de Xpm, et nous avons montré que la plupart des TALE d'une souche sont bien éteints par un seul sgRNA, provoquant une diminution des symptômes et des titres bactériens in planta. En outre, des TALE protégés contre les sgRNAs sont bien exprimés dans les souches exprimant les sgRNA, ce qui permet des tests de complémentation. L’utilisation de cet outil chez X. cassavae, un pathogène non vasculaire du manioc, montre une réduction forte des symptômes révélant l’implication des TALEs dans la virulence de ce pathogène orphelin. Notre étude fournit une plateforme CRISPRi utile pour évaluer le rôle des TALEs lors de la colonisation de l'hôte, et globalement, pour l'analyse fonctionnelle de familles multigéniques chez cette espèce.

Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a staple crop that feeds about 800 million people and supports the economy of low-income farmers in tropics. Due to its outstanding performance, cassava grows under a wide range of temperatures, soil pH, salinity degrees, and water availability, which is highly desirable for climate change adaptation. Biotic stresses affecting cassava include pests and pathogens, being viral and bacterial pathogens the most economically relevant. The cassava mosaic disease and the cassava brown streak disease are the two main viral cassava diseases, which cause important yield losses. Among bacterial pathogens, Xanthomonas phaseoli pv. manihotis (Xpm), causal agent of the Cassava Bacterial Blight (CBB), is the most relevant one. CBB is a vascular disease characterized by water-soaked angular leafspots, leaf blight, wilting, stem rotting, and dieback. Xpm relies on its effectors to subvert plant immunity and establish successful infections. These effectors include Xanthomonas outer proteins and Transcription Activator-Like effectors (TALEs). TALEs are bacterial effectors that, once translocated to the host cell, migrate to the nucleus and search for specific DNA motifs (effector binding element - EBE) by means of their repetitive central region. Once located onto the target EBE, the C-terminal region interacts with host transcription factors and recruits the RNA polymerase to initiate transcription of downstream genes. TALEs play key roles in Xpm pathogenesis, notably through the transcriptional activation of susceptibility (S) genes like the sugar transporter MeSWEET10a. Although it is known that TAL20Xam668 and TAL14Xam668 and their homologs are key factors that enhance water-soaking and in-planta bacterial growth (known as major virulence TALEs), little is known about TALE diversity among Xpm populations, the distribution of the major virulence TALEs, and other mechanisms used by Xpm to promote disease. In this thesis, we addressed these matters in three chapters: i) diversity and function of TALEs, ii) search for alternative S genes, and iii) development of a CRISPRi-based tool to study TALE biology. The study of TALE diversity and function revealed 13 novel variants in Xpm, including a variant with 22 repeats that activates the S gene MeSWEET10a. Moreover, we identified two potential cases of functional convergence. The relevance of these results lies in the description of new variants of major virulence TALEs and potential TALE-targeted hubs. The study of alternative S genes led to the identification of another SWEET sugar transporter, MeSWEET10e, that is transcriptionally activated by Xpm, potentially as a secondary target of TALE15 variants. Phylogenies indicate that Xpm TALEs and their linked capabilities to activate MeSWEETs come from at least two different ancestor genes (convergent evolution). These findings will be useful in the conception of Xpm-resistant cassava varieties. Finally, as we faced difficulties to mutate TALEs in some Xpm strains, we set a silencing platform based on CRISPR interference (CRISPRi), which could be extrapolated to other gene families and other Xanthomonas species. Three single guide RNAs (sgRNAs) were designed to silence Xpm TALEs, and our data show that most TALEs in a strain can be silenced by one individual sgRNA. CRISPRi silencing resulted in decreased symptoms and lower in-planta bacterial titers. Furthermore, plasmid-borne TALEs protected against sgRNAs were expressed in the strains undergoing silencing and allowed complementation. Implementation of this platform in Xanthomonas cassavae, a non-vascular pathogen of cassava, demonstrated for the first time the role of TALEs in this orphan pathosystem and suggested the role of MeSWEET10a as a target of Xc. Our study provides a useful CRISPRi platform to assess the role of TALEs during host colonization, and overall, for the functional analysis of multigene families in this species.