Analyse génétique exhaustive du mécanisme de transformation naturelle chez Legionella pneumophila et caractérisation d'un nouvel acteur conservé chez les bactéries Gram-négative

Comprehensive genetic analysis of the natural transformation mechanism in Legionella pneumophila and characterization of a novel actor conserved in Gram-negative bacteria

• Auteur / Autrice : Léo Hardy
• Direction : Xavier Charpentier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie moléculaire
• Date : Soutenance le 15/12/2021
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre International de Recherche en Infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Sophie Jarraud
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Xavier Charpentier, Pablo Radicella, Nathalie Leblond-Bourget, Mireille Ansaldi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pablo Radicella, Nathalie Leblond-Bourget

Mots clés

Mots clés contrôlés

Tn-Seq (génétique)

Transposons

Transfert génétique

Transformation génétique

Legionella pneumophila

Mots clés libres

Transformation naturelle

Transfert horizontal de gène

Compétence

Recombinaison homologue

Legionella pneumophila

YraN

Tn-seq

Bactérie gram négative

Natural transformation

Horizontal gene transfer

Competence

Homologous recombination

Legionella pneumophila

YraN

Tn-seq

Gram negative bacteria

Résumé

La transformation naturelle est un mécanisme de transfert horizontal de gène très répandu chez les bactéries. C’est l’un des moteurs de la diversité bactérienne qui peut conduire à l’émergence de nouvelles bactéries pathogènes et de nouvelles résistances aux antibiotiques. La transformation naturelle désigne la capacité de certaines bactéries dites « transformables » à capturer de l’ADN nu exogène et de l’intégrer dans leur génome par recombinaison homologue. Elle met en jeu de nombreux acteurs protéiques regroupés sous le nom de « machinerie d’import de l’ADN ». Cette machinerie est largement conservée chez les différentes espèces transformables. Elle n’est exprimée que lorsque la bactérie est dans un état génétiquement programmé et le plus souvent transitoire qu’on appelle « la compétence ». Les conditions d’induction ainsi que les voies de régulation qui aboutissent à cet état physiologique particulier varie largement en fonction des espèces transformables. Malgré des avancées considérables ces dernières années, les situations qui stimulent la transformation naturelle restent encore mal comprises. De même, le fonctionnement de la machinerie d’import n’est que partiellement élucidé. Tous les composants ne sont pas encore identifiés et il est possible que des processus fondamentaux de la cellule participent au fonctionnement du système. Mon premier objectif était d'identifier de façon exhaustive tous les gènes requis pour la transformation naturelle de Legionella pneumophila, une bactérie gram négative à multiplication intracellulaire. A cette fin, j’ai mis au point une méthode de Tn-seq chez ce pathogène. Le Tn-seq est une méthode puissante qui permet, à partir d’une banque de mutants insertionnelles d’identifier de façon exhaustive les mutants des gènes ayant perdu une fonction donnée. Les étapes de construction de la banque de L. pneumophila jusqu’à l’analyse bioinformatique des données de Tn-seq, jamais réalisés jusqu’alors pour cette espèce, ont fait l’objet d’une publication technique. L’analyse des données de Tn-seq issus de cribles de transformation m’a permis de confirmer le rôle de la plupart des gènes déjà connus pour être impliqués dans la transformation naturelle chez cette espèce et a permis de préciser le rôle de pilines mineures et majeures. Cette analyse m'a surtout aussi permis d’identifier un nouvel acteur : YraN, conservé chez la majorité des espèces gram négative et jusqu’alors de fonction inconnue. La caractérisation de ce nouvel acteur par des approches génétiques et moléculaires a permis de montrer qu’YraN était une nucléase impliquée dans les voies moléculaires dédiées à la recombinaison de l’ADN transformant.

Natural transformation is a widespread mechanism of horizontal gene transfer in bacteria. It is one of the drivers of bacterial diversity that can lead to the emergence of new pathogenic bacteria and antibiotic resistance. Natural transformation refers to the ability of certain so-called "transformable" bacteria to capture exogenous naked DNA and integrate it into their genome by homologous recombination. It involves numerous protein players grouped under the name of "DNA uptake machinery". This machinery is largely conserved in the various transformable species. It is only expressed when the bacterium is in a genetically programmed and most often transient state called "competence". The conditions of induction as well as the regulatory pathways that lead to this particular physiological state vary widely between transformable species. Despite considerable progress in recent years, the situations that stimulate natural transformation are still poorly understood. Similarly, the functioning of the import machinery is only partially elucidated. Not all components have been identified yet and it is possible that fundamental processes in the cell are involved in the functioning of the system. My first objective was to comprehensively identify all the genes required for the natural transformation of Legionella pneumophila, a gram-negative bacterium which replicates intracellulularly. To this end, I developed a Tn-seq method for this pathogen. Tn-seq is a powerful method that allows, from a library of insertional mutants, to exhaustively identify mutants of genes that have lost a given function. The steps from the construction of the L. pneumophila library to the bioinformatics analysis of the Tn-seq data, which has never been done before for this species, have been the subject of a technical publication. The analysis of Tn-seq data from transformation screens allowed me to confirm the role of most of the genes already known to be involved in natural transformation in this species and to clarify the role of minor and major pilins. This analysis also allowed me to identify a new actor: YraN, conserved in the majority of gram-negative species and previously of unknown function. The characterisation of this new actor by genetic and molecular approaches showed that YraN was a nuclease involved in the molecular pathways dedicated to the recombination of transforming DNA.