Décoder les mécanismes de toxicité et de sécrétion de la protéine TIR PumA de Pseudomonas aeruginosa

Deciphering the toxicity and secretion mechanisms of the TIR domaincontaining effector PumA from Pseudomonas aeruginosa

• Auteur / Autrice : Morgane Roussin
• Direction : Suzana Salcedo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 22/09/2021
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d’inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Marc Lemaire
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Suzana Salcedo, Ina Attree-Delic, Eric Cascales, Alain Filloux, Romé Voulhoux
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ina Attree-Delic, Eric Cascales

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résistance aux antibiotiques

Virulence (microbiologie)

Pseudomonas aeruginosa

Réponse immunitaire

Mots clés libres

Pseudomonas

Compétition

Virulence

SST6

NADase

Domaine TIR

Pseudomonas

Competition

Virulence

T6SS

NADase

TIR domain

Résumé

Introduction et objectifs : Le domaine TIR (Toll/interleukin-1 Receptor), présent au sein de tous les TLRs (Toll-like Receptors) et les adaptateurs associés, est un composant clé du système immunitaire inné. La détection d’un pathogène déclenche l’interactions entre les domaines TIR de ces protéines permettant la signalisation par les TLRs et enfin l’activation de la réponse inflammatoire. Ces dernières années, de nombreux travaux ont révélé le rôle d’une famille d’effecteurs bactériens contenant un domaine TIR capables de détourner ces signaux précoces de l’immunité. Dans le contexte des pathogènes nosocomiaux, une récente étude menée dans le laboratoire a montré que l’effecteur TIR PumA est un facteur de virulence clé de la souche Pseudomonas aeruginosa PA7. PumA interagit avec les adaptateurs MyD88 et TIRAP, et module l’activation de la réponse immunitaire en contrôlant notamment la translocation du facteur de transcription NF-κB. De plus, de récents travaux ont montré que le domaine TIR possède une activité enzymatique NADase, c’est-à-dire la capacité à dégrader le NAD+ de l’hôte, un métabolite central dans beaucoup de processus cellulaires. Cependant, bien que les mécanismes impliqués dans le détournement de la réponse immunitaire aient été largement étudiés, le rôle des effecteurs contenant un domaine TIR dans la modulation du métabolisme de l’hôte ainsi que leur mécanisme de sécrétion restent encore très peu étudiés. Mon projet de thèse a pour objectif de caractériser les mécanismes de toxicité et de sécrétion de l’effecteur PumA chez P. aeruginosa PA7, une souche atypique et multi-résistante aux antibiotiques. Résultats : Trois loci différents codant le SST6 sont présents dans le génome de P. aeruginosa : SST6-H1, -H2, et -H3. Alors que le SST6-H1 est connu pour cibler uniquement les bactéries, le SST6-H2 et le SST6-H3 sont également capables de cibler les cellules eucaryotes. Nous avons découvert que le SST6 est impliqué dans la translocation de PumA dans les cellules infectées, ce qui entraîne l'inhibition de la réponse immunitaire mais aussi la réduction de la concentration cellulaire en NAD+. De manière surprenante, nous avons également découvert que PumA est impliqué dans la compétition bactérienne, injectée dans des bactéries voisines via un SST6 différent. Cette toxicité induite par PumA est due à l'activité consommatrice de NAD+ (NADase) de son domaine TIR. De plus, nous avons montré qu’en début d’infection PumA localise au niveau de la membrane plasmique, puis se retrouve dans des compartiments intracellulaires contenant MyD88. Pour finir, nous avions précédemment montré au laboratoire qu’une souche de P. aeruginosa non-TIR (PA14) exprimant de manière artificielle PumA était aussi capable d’inhiber la réponse immunitaire (Imbert et al. 2017). Nous nous sommes donc intéressés à connaitre le mécanisme de sécrétion utilisé par PA14 pour délivrer PumA. Nous avons découvert que PA14 exprimant PumA produit des vésicules extracellulaires contenant PumA, et que ces vésicules elles-mêmes sont capables, après contact avec les cellules épithéliales, de réduire la réponse immunitaire et la concentration en NAD+ à l’inverse des vésicules produites par la souche sauvage (n’exprimant pas PumA). Par la suite, nous avons montré que le SST6 de cette souche semble impliqué dans l’injection de PumA en infection, mais aussi dans la cible bactérienne E. coli. En résumé, nos résultats identifient PumA comme un nouvel effecteur trans-règne du SST6 présentant une activité NADase une fois injecté dans des cellules eucaryotes et procaryotes. À notre connaissance, il s'agit de la première description d'un effecteur bactérien utilisant un SST6 sélectif en fonction de la cellule cible. De plus, nous avons montré que l’expression artificielle de PumA dans une souche non-TIR est suffisante pour augmenter la virulence de la bactérie, alors capable de mettre en place différents systèmes pour injecter PumA dans l’hôte.

Introduction and objectives: The Toll/interleukin-1 Receptor (TIR) domain, present in all Toll-like Receptors (TLRs) and associated adaptors, is a key component of the innate immune system. Detection of a pathogen triggers interactions between the TIR domains of these proteins allowing signaling by TLRs and ultimately the activation of the inflammatory response. In recent years, numerous studies have revealed the role of a family of bacterial effectors containing a TIR domain capable of hijacking these early immune signals. In the context of nosocomial pathogens, a recent study conducted in the laboratory showed that the TIR effector PumA is a key virulence factor of the Pseudomonas aeruginosa PA7 strain in mice and nematodes. PumA interacts with the adaptor proteins MyD88 and TIRAP, and modulates the activation of the immune response by controlling the translocation of the transcription factor NF-κB. PumA is also able to target UBAP1, a component of the ESCRT-1 complex involved in vesicular transport and cytokine receptor activation. In addition, recent work has shown that the TIR domain possesses NADase enzymatic activity, i.e. the ability to degrade host NAD+, a central metabolite in many cellular processes. However, although the mechanisms involved in the hijacking of the immune response have been extensively studied, the role of TIR domain-containing effectors in the modulation of host metabolism and their mechanism of secretion remain largely unexplored. The aim of my thesis project is to characterize the mechanisms of toxicity and secretion of the PumA effector in P. aeruginosa PA7, an atypical strain that is multi-resistant to antibiotics. Results: Three different loci encoding T6SS are present in the P. aeruginosa genome: H1-, H2-, and H3-. While H1-T6SS is known to target only bacteria, H2-T6SS and H3-T6SS are also capable of targeting eukaryotic cells. We found that T6SS is involved in the translocation of PumA into infected cells, resulting in the inhibition of the immune response but also in the reduction of the cellular NAD+ concentration. Surprisingly, we also found that PumA is involved in bacterial competition, injected into neighboring bacteria such as Escherichia coli and Acinetobacter baumannii via a different T6SS. This PumA-induced toxicity is due to the NAD+ (NADase) consuming activity of its TIR domain. Furthermore, we imaged the cellular localization of PumA after injection into eukaryotic and prokaryotic host cells during infection. We showed that at the beginning of infection PumA localises to the plasma membrane and then into intracellular compartments containing MyD88. Finally, we had previously shown in the laboratory that a non-TIR P. aeruginosa strain (PA14) artificially expressing PumA was also able to inhibit the immune response (Imbert et al. 2017). We found that PA14 expressing PumA produces extracellular vesicles containing PumA, and that these vesicles themselves are able, after contact with epithelial cells, to reduce the immune response and the NAD+ concentration in contrast to the vesicles produced by the wild-type strain (not expressing PumA). We have shown that the PA14 T6SS seems to be involved in the injection of PumA into infection, but also in the bacterial target E. coli. In summary, our results identify PumA as a novel T6SS trans-kingdom effector with NADase activity when injected into eukaryotic and prokaryotic cells. To our knowledge, this is the first description of a bacterial effector using a target cell-selective SST6. Furthermore, we have shown that artificial expression of PumA in a non-TIR strain is sufficient to increase the virulence of the bacterium, which is then able to set up different systems to inject PumA into the host.