Optimisation d'une plateforme de vaccin ARNm contre le VIH-1 : de la conception de la transcription in vitro à l'expression des protéines d'enveloppe

Optimising a mRNA Vaccine platform against HIV-1 : from the in vitro transcription design to envelope protein expression

• Auteur / Autrice : Sergio Linares Fernández
• Direction : Jean-Yves Exposito, Bernard Verrier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie, Biologie, Santé
• Date : Soutenance le 09/07/2021
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie tissulaire et d'ingénierie thérapeutique (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Mathias Faure
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Yves Exposito, Bernard Verrier, Béhazine Combadière, Montserrat Plana Prades, Chantal Pichon, Stéphane Paul, Nathalie Garçon
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Béhazine Combadière, Montserrat Plana Prades, Chantal Pichon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nanoparticules lipidiques

ARN messagers

Lutte contre

VIH (virus)

Recherche

Vaccins

Mots clés libres

Vaccins à ARNm

Réponses immunitaires

Séquence ARNm

Purification

In vivo

In vitro

Optimisation

Vaccins

Résumé

Le développement du premier vaccin à ARNm contre la pandémie de coronavirus de 2020 fait désormais partie des annales de la vaccinologie. Cependant, la réactogénicité globale de cette première génération de vaccins à ARNm est loin d'être parfaite. Le but de cette thèse concerne la conception et l'optimisation de l’efficacité d'un vaccin ARNm contre le VIH-1 de l’optimisation de la séquence ARNm à sa production et purification, jusqu'à la sélection de l'antigène et de la preuve de concept in vivo. Nous avons conçu et optimisé les séquences non-traduites d'ARNm codant pour l’eGFP et comparé l’impact de ces séquences sur la traduction par rapport à un ARNm standard basé sur les régions non traduites de la β-globine humaine. Tout d’abord, nous avons évalué in vitro l’impact de différentes tailles de queues poly-A et avons continué en modifiant la séquence 5’UTR avec des séquences synthétiques permettant un recrutement efficace des ribosomes. Cette étude nous a permis de démontrer l’impact positif d’une séquence poly(A) de 148 unités et de l’UTR4 synthétique, et de construire les bases non-codantes de notre ARNm de travail ou ARNm optimisé. Une fois les séquences optimisées, nous nous sommes concentrés sur la production et la purification des sous-produits d'ARNm générés lors de la réaction de transcription in vitro. Pour cela, nous avons ajouté une structure coiffe à l’ARNm en utilisant des analogues ou une réaction enzymatique, puis éliminer l’ARNm double-brin avec de la cellulose, et traité les ARNm par la phosphatase. Nous avons ainsi montré que l’addition enzymatique d’une structure coiffe couplé à une purification cellulose plus un traitement à la phosphatase permettaient d’augmenter d’environ 300% l'expression de l'eGFP in vitro. Nous avons ensuite utilisé les avantages de cette plate-forme d’ARNm dans la conception d'un candidat ARNm contre le VIH-1. Nous avons sélectionné 7 séquences antigéniques différentes, et leurs séquences codantes respectives ont été clonées dans notre ARNm optimisé. Dans le but d'améliorer la réponse immunitaire, un nouveau domaine permettant une multérisation de la protéine cible a été ajouté en partie N-terminale de certains antigènes. Les ARNm ont ensuite été formulés en nanoparticules lipidiques (MC3: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG-2000) par microfluidique. Les formulations ont été caractérisées par diffusion de la lumière (pour le diamètre, le potentiel Z et la polydispersité) et par fluorimétrie pour mesurer l'encapsulation de l'ARNm. Les résultats ont démontré une efficacité d'encapsulation globale élevée, une petite taille des particules et une charge quasi-neutre. La traduction des ARNm encapsulés a été validée in vitro par immunofluorescence. Ces résultats nous ont permis de poursuivre la preuve de concept in vivo chez la souris. Des souris CB6F-1 ont été immunisées avec le complexe LNPs-ARNm pour évaluer la réponse immunitaire humorale. Sept groupes de six souris ont été immunisés par voie sous-cutanée avec les ARNm complexés dans les LNP. Les souris ont été immunisées avec trois doses faibles d’ARNm (1,5 ug ou 3 ug) aux jours 0, 14 et 28. Des IgG sériques ont été observées dans 6 des 7 groupes. Nous avons observé une augmentation non-significative des IgG sériques anti-env entre les groupes 5’UTR-4 et HBB-5’UTR. La protéine multimérique a montré une augmentation du titre d’IgG sérique par rapport aux homologues d'ARNm codant pour des protéines monomériques, bien que ces résultats doivent être complétés et validés. Enfin, et quel que soit le groupe de souris analysé, aucune production d’IgA n'a pu être détectée dans les lavages vaginaux. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse encouragent la poursuite de l'évaluation préclinique d'un candidat vaccin ARNm du VIH-1 dans d'autres modèles animaux, comme le lapin. De plus, du fait de la polyvalence de la technologie de l'ARNm, notre plate-forme d'ARNm optimisée pourra être utilisée contre d'autres maladies infectieuses.

The development of the first mRNA vaccine against the coronavirus pandemic of 2020 is now part of the annals of vaccinology. However, the overall reactogenicity of this first generation of mRNA vaccines is far to be perfect. The aim of this thesis concerns the design and optimization of the potency of an mRNA vaccine against HIV-1, starting from the mRNA sequence, production, purification, to the antigen selection and the in vivo proof of concept. Therefore, we designed and optimized the sequence of a standard mRNA backbone based on the untranslated region of the human β-globin. First, we evaluated in vitro the impact of different poly-A tails, and continue modifying the 5’UTR sequence with synthetic high ribosome loading sequences, demonstrating the benefit of a long poly-A tail of 148 adenines and the use of the synthetic UTR4. Once optimised the sequences, we focused on the production and purification of mRNA by-products generated during the in vitro transcription reaction. We capped the mRNA using antireverse cap analogs and enzymatic vaccinia capping, to later treat and purify the mRNA with cellulose, phosphatase or using a double purification. The results showed up to a 300% increased in eGFP expression in vitro. Once optimised the mRNA platform, we applied these advantages into the design of an mRNA candidate against HIV-1. We selected 7 different antigenic sequences to encode them into our platform. Among the antigens, we fused some of the antigens to a novel multimeric protein, looking forward to improving the immune response. Moreover, the mRNAs were formulated into lipid nanoparticles (MC3: DSPC: Cholesterol: DMG-PEG-2000) by microfluidics. The formulations were characterised by dynamic light scattering (for size, Z-potential and polydispersity) and by fluorometric assay to measure the mRNA encapsulation. The results demonstrated an overall high encapsulation efficiency, small particle size and quasi-neutral charge. All the mRNAs expression was validated in vitro using by immunofluorescence. These results allowed us to continue to the in vivo proof of concept in mice. CB6F-1 mice were immunized with the LNPs-mRNA complex to evaluate the humoral immune response. Seven groups, containing six mice per group, were immunized subcutaneously with the mRNAs complexed in LNPs. Mice were immunized with three low doses schedule at days 0, 14 and 28, containing 1.5 µg or 3 µg. Seric IgG was observed in 6 out 7 groups. We observed a not significant improvement in the seric IgG anti-env between the 5’UTR-4 and the HBB-5’UTR. The multimeric protein showed an improvement in the seric IgG compared to the monomeric mRNAs counterparts, although the results should be completed and validated. Finally, no IgA antibodies were detected in the vaginal lavages in any of the conditions. Altogether, the results presented in this thesis encourages the continuation of the preclinical evaluation of an HIV-1 mRNA vaccine candidate in others animal models, such as rabbits. Moreover, the versatility of mRNA technology may help to use the optimized mRNA platform, here designed, against other infectious diseases.