Design of versatile injectable porous hydrogels : new perspectives for skeletal muscle tissue regeneration and in vitro evaluation of myogenesis

Formulation d'hydrogels injectables poreux et modulables : nouvelles perspectives pour la régénération du tissu musculaire squelettique et l'évaluation de la myogénèse in vitro

• Auteur / Autrice : Louise Griveau
• Direction : Jérôme Sohier, Romain Debret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie biologique et médicale, Biotechnologie
• Date : Soutenance le 29/04/2021
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie tissulaire et d'ingénierie thérapeutique (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Laurent David
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jérôme Sohier, Romain Debret, Sébastien Banzet, Karine Anselme, Maud Frieden, Catherine Le Visage
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sébastien Banzet, Karine Anselme, Maud Frieden

Mots clés

Mots clés contrôlés

Porosité

Génie tissulaire

Hydrocolloïdes

Muscles -- Régénération (biologie)

Mots clés libres

Hydrogel

Injectable et poreux

Ingénierie tissulaire

Régénération musculaire

Effervescence

Hydrogel

Injectable and porous

Tissue Engineering

Skeletal muscle regeneration

Effervescence

Résumé

Les pertes musculaires volumétriques résultant d’incidents traumatiques baissent drastiquement les capacités de régénération du muscle et manquent actuellement de traitements. Les hydrogels, des réseaux polymériques fortement hydratés, sont des candidats thérapeutiques prometteurs pouvant être injectés dans les plaies afin de remplacer temporairement la matrice extracellulaire et guider les cellules vers la régénération fonctionnelle du tissu. Cependant, la capacité de régénération de ces biomatériaux dépend de la création d’une porosité afin de permettre l’infiltration cellulaire et vasculaire. Au sein du laboratoire, un hydrogel synthétique à base de poly(lysines) (DGL) réticulés à des chaines de poly(éthylène) glycol (PEG) a récemment été décrit. Ses propriétés mécaniques modulables et sa capacité d’interaction avec les cellules en font un hydrogel prometteur pour de nombreuses applications en ingénierie tissulaire. Les objectifs de ce travail ont donc été dans un premier temps de trouver les paramètres optimaux de cet hydrogel DGL/PEG pour soutenir la culture de progéniteurs de cellules musculaires (myoblastes) pour ensuite créer une porosité au sein de l’hydrogel grâce à une méthode innovante effervescente compatible avec son injection. Finalement, la capacité de ces nouvelles formulations injectables et poreuses à soutenir la prolifération et la différentiation de myoblastes a été évaluée dans le but final de proposer un traitement pour la régénération du muscle strié squelettique. Dans ce travail de thèse, le comportement de myoblastes a été étudié sur des hydrogels denses DGL/PEG et a montré être corrélé aux propriétés mécaniques et à la composition du support. Des conditions favorables pour la prolifération et la différentiation des myoblastes ont donc été identifiées et ciblées pour la mise en place d’une porosité, permettant l’infiltration cellulaire au sein de l’hydrogel. Les hydrogels poreux effervescents (EPH) ont été préparés en dissolvant un acide carboxylique et une base carbonée aux précurseurs liquides de DGL et de PEG afin de permettre la génération contrôlée de bulles de CO2 par effervescence. La simultanéité de l’effervescence à la réaction de réticulation de l’hydrogel DGL/PEG a permis de piéger les bulles de CO2, menant à la création d’une porosité interconnectée à l’intérieur du réseau polymérique. Les hydrogels poreux, injectés en sous cutané chez la souris via un système de seringue double, ont été prouvés biocompatibles et promouvant une vascularisation étendue. Finalement, des myoblastes primaires humains étudiés en contact des EPH ont montré fusionner ensemble pour former des myotubes capables de contracter spontanément. La présence de cellules non prolifératives, n’entrant pas en différentiation et exprimant le marqueur de cellules souches musculaire (Pax7) ont aussi été observées au sein des EPH. Ces résultats consolident le potentiel des EPH à soutenir la maturation de fibres musculaires tout en intégrant la formation et le réapprovisionnement des niches de cellules souches. Par conséquent, nous décrivons ici un hydrogel poreux innovant et mécaniquement modulable ayant un potentiel pour la prise en charge des pertes musculaires volumétriques à travers une application rapide et directe par injection.

Volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic incidents drastically decreases muscle regeneration capacity and lacks treatments. Injectable hydrogels, which are highly hydrated polymeric networks, represent promising therapeutic candidates able to temporarily replace the native extracellular matrix, providing support for cells to regenerate the tissue. However, injectable hydrogel regeneration potential is strongly reliant on the presence of porosity allowing cell infiltration and efficient vascularization. Recently, an innovative hydrogel composed of poly-lysine dendrimers (DGL) cross-linked by polyethylene glycol (PEG-NHS) has been described in the laboratory. The DGL/PEG hydrogel is biocompatible and has highly tailorable mechanical properties but requires a preformed porosity to be colonized with cells. Therefore, this work aimed (1) to investigate the ability of the DGL/PEG hydrogel to sustain muscle cells progenitor (myoblasts) proliferation and differentiation, (2) to then create a spontaneous porosity inside DGL/PEG hydrogels through a novel effervescent approach compatible with its injection and finally (3) to evaluate new formulation ability to sustain muscle cells progenitor differentiation for skeletal muscle regeneration. The behaviour of myoblasts on hydrogels of various conditions was correlated with the mechanical properties and the composition of the support. Optimal conditions for myoblasts proliferation and differentiation could thus be targeted for the establishment of the porosity to enable cellular infiltration within the hydrogel. We found that effervescent porous hydrogels (EPHs) of versatile mechanical properties could be prepared by dissolving a carboxylic acid and a carbonated base to DGL and PEG solutions, to generate CO2 bubbles by effervescence. The simultaneous reaction of effervescence with the DGL/PEG crosslinking allowed the CO2 bubbles entrapment inside DGL/PEG network leading to the formation of a spontaneous, homogeneous and interconnected porosity. The use of sole precursor solutions allowed to inject the formulations with a dual syringe and a static mixer, leading to porous hydrogels that were proven biocompatible by subcutaneous injection in mice. As a striking result, primary human myoblasts seeded into 3D EPHs showed extensive myotube formation with visible striation and ability to spontaneously contract. The presence of quiescent and non-differentiated cells inside EPHs was confirmed with myogenic regulatory factor Pax7. These results consolidate EPHs potential to support muscle fibres maturation while replenishing stem cell niches, holding promise for tissue engineering applications. In conclusion, we describe a novel porous hydrogel with potential as a scalable solution for VML treatments within a swift and straightforward injectable delivery, which provides optimal support for muscle cells progenitors to differentiate into contractile myotubes while maintaining a pool of muscle stem cells.