Évaluation in-vitro et in-vivo de la thérapie photodynamique associée à l’acide 5-Aminolevulinique sur le carcinome hépatocellulaire humain : impact sur la régulation du système immunitaire

Evaluation of in-vitro and in-vivo 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy on human hepatocellular carcinoma : impact on immune system regulation

• Auteur / Autrice : Abhishek Kumar
• Direction : Emmanuel Boleslawski
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 10/06/2021
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Thérapies Assistées par Lasers et Immunothérapies pour l’Oncologie (Lille) - Thérapies Laser Assistées par l'Image pour l'Oncologie - U 1189 / ONCO-THAI
• Jury : Président / Présidente : Nadirah Delhem
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Filoména Conti, Serge Mordon, Alexandre Louvet, Céline Frochot
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Nicolas Boisgerault, Samir Acherar

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules -- Prolifération

Collagène

Fibrose

Souris atteinte d'immunodéficience combinée grave

Immunomodulation

Photochimiothérapie

Carcinome hépatocellulaire

Mots clés libres

Acide 5-aminolévulinique

Cellule mononucléée du sang périphérique (PBMC)

Photodynamic Therapy

5-Aminolevulinic acid (5-ALA)

Hepatocellular Carcinoma

Immune System

SCID mice

Résumé

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est le principal cancer primitif du foie avec un taux d’incidence qui a augmenté ces dernières années. Malgré les nombreuses options thérapeutiques disponibles, le CHC est associé à une mortalité très élevée. Dans ce contexte, il apparaît nécessaire de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui pourraient augmenter l'efficacité des traitements conventionnels, ainsi que la survie sans progression.La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité antitumorale locorégionale reposant sur l'administration systémique d'une molécule non toxique, appelée photosensibilisateur (PS), et l'illumination secondaire par une lumière de longueur d'onde et d'énergie appropriées afin de provoquer la mort des cellules tumorales.Nous avons évalué l'impact in vitro de la PDT (i) sur des lignées humaines de CHC, (ii) sur des hépatocytes tumoraux de patients, (iii) sur des myofibroblastes hépatiques de donneurs sains et (iv) sur des cellules immunitaires humaines, en utilisant l'acide 5-aminolévulinique (5-ALA) [la protoporphyrine IX, étant le réel PS]. Dans un second temps, nous avons validé nos résultats sur un modèle in vivo de CHC. L'objectif global était d'établir la validité de la 5-ALA-PDT comme adjuvant à l'hépatectomie partielle par des procédures peropératoires.Lorsque les lignées cellulaires de CHC ont été traitées avec des concentrations variables de 5-ALA et des doses de lumière adaptées, nous avons observé une diminution dose-dépendante de la viabilité cellulaire. Ces résultats confirment que le 5-ALA- PDT induit la mort des lignées cellulaires de CHC humaines.En outre, afin de valider l’efficacité ex vivo de la 5- ALA-PDT nous avons étudié l'impact de cette thérapie sur des hépatocytes tumoraux de quatre patients atteints de CHC, montrant que la viabilité cellulaire diminuait en continu jusqu'à 4 fois, à partir du jour 3 après l'illumination, comparativement au témoin non traité. Par ailleurs, nous avons étudié l'innocuité de la 5-ALA-PDT sur des myofibroblastes hépatiques de donneurs sains. Nos résultats montrent que la 5-ALA-PDT n’induit aucun changement en terme de viabilité, de prolifération et que les niveaux d'expression de l'ARNm des marqueurs de fibrose, à savoir la collagène-1, HSP47, αSMA, TIMP1 et MMP2 ne sont pas modifiés. De plus, aucune modulation des niveaux de sécrétion de collagène n’a été observé.Plus intéressant encore, lorsque nous avons cultivé des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) activées, avec des milieux conditionnés obtenus à partir de surnageants de lignées cellulaires de CHC traitées par la 5-ALA PDT, nous avons observé une prolifération cellulaire accrue par rapport au contrôle non traité. Cela met en évidence l'expansion clonogénique et l'activation possible de la réponse immunitaire anti-tumorale par la 5-ALA PDT. Ce milieu conditionné a en outre induit une inhibition de la prolifération des lignées de CHC suggérant une sécrétion de facteurs anti-prolifération par les cellules cancéreuses traitées par la 5-ALA PDT.Enfin, dans un modèle de CHC chez la Souris SCID humanisée, traitée par 5-ALA PDT, la PpIX avait une accumulation plus élevée dans la tumeur que dans les tissus non tumoraux et on observait une diminution du taux de croissance tumorale, par rapport au groupe contrôle non-traité.À ce jour, aucune autre étude n'a évalué l'impact de la 5-ALA PDT sur des prélèvements de patients et de donneurs sains. Nous sommes également les premiers à avoir évalué l'impact des milieux conditionnés traités par 5-ALA PDT sur les PBMC et la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses. Notre étude renforce le projet d'application la 5-ALA PDT au traitement des patients atteints de CHC. D'autres études ultérieures viseront à identifier la population immunitaire activée par la PDT, à évaluer l'efficacité de la thérapie dans un modèle de souris SCID humanisé et à établir un protocole de traitement standard à utiliser dans un ensemble clinique.

In recent years, there has been a steady increase in patients with Hepatocellular Carcinoma (HCC) mainly in the north of France. Despite a large number of therapeutic options, HCC has a high cancer-related mortality. Hence there is a need to develop novel therapeutic strategies for HCC treatment which could augment the efficacy of existing options and at the same time provide longer tumor free survival for the patients.Photodynamic Therapy (PDT) is a local anti-tumoral modality relying on systemic administration of a non-toxic dye, called Photosensitizer (PS), and subsequent illumination by light of appropriate wavelength and energy to elicit tumor cell death. Initially used for treatment of dematological ailments, PDT has shown motivating results as a possible anti-tumoral therapy in last few decades.Using 5-Aminolevulinic acid (5-ALA), the US-FDA approved oral pro-drug of Protoporphyrin IX, the actual PS, we investigated the in-vitro impact of PDT over HCC cell lines, along with patient tumoral hepatocytes, healthy donor liver myofibroblasts and human immune system. At last, we validated our results on an in-vivo model of HCC. The overall aim is to establish 5-ALA PDT as an adjuvant to partial hepatectomy through intra-operative procedures.When the HCC cell lines were treated with varying 5-ALA concentration and light doses, we observed a dose-dependent decrease of cellular viability. We also observed varying sensitivity for 5-ALA PDT between the three HCC cell lines used (HuH7, Hep3B, HepG2), highlighting the role of p53 for underlying cell death mechanism. Thereafter, an IC50 dose for each of the cell line was obtained which induced decreased cellular proliferation and increased cell death with respect to non-treated control. These results confirm that 5-ALA PDT induce cell death to the HCC cell lines.Furthermore, in order to validate the ex vivo efficacy of 5- ALA-PDT we studied the impact of this therapy on tumor hepatocytes from four patients with HCC, showing that cell viability decreased continuously up to 4 times, from day 3 after illumination, compared to the untreated control. In addition, we have studied the safety of 5-ALA-PDT in liver myofibroblasts from healthy donors. Our results show that 5-ALA-PDT does not induce any change in terms of viability and proliferation of healthy myofibroblasts and that the levels of expression of the mRNA of the markers of fibrosis, namely collagen-1, HSP47, αSMA, TIMP1 and MMP2 are not modified. In addition, no modulation of the levels of collagen secretion was observed.Most interestingly, when we cultured human activated Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs), with conditioned media obtained from 5-ALA PDT treated HCC cell lines, we observed increased cellular proliferation with respect to non-treated control. This highlights clonogenic expansion and possible anti-tumor immune response activation by 5-ALA PDT. This conditioned media have further inhibit the proliferation of respective cancer cell lines, reflecting secretion of anti-proliferation factors by cells due to PDT.At last, our in-vivo results demonstrated that PpIX has higher accumulation in the tumor with respect to non-tumoral tissues and a decrease in the rate of tumor growth for humanized SCID mice treated by 5-ALA PDT, with respect to Non-Treated control group.To date, no other study has evaluated the impact of 5-ALA PDT on primary patient and healthy donor samples. We are also the first to assess the impact of 5-ALA PDT treated conditioned media on PBMCs and cancer cell line proliferation. Our study strengthens the notion of the application of intra-operative 5-ALA PDT for treatment of HCC patients. Further studies will aim to understand the role of p53 in the cell death mechanism, identify the immune population activated by PDT, evaluate the efficacy of the therapy in a humanized SCID mice model and establish a standard treatment protocol to be utilized in a clinical set-up.