Importance du microenvironnement dans les modèles cérébraux in vitro pour le criblage phénotypique

Importance of the microenvironment in cerebral in vitro models for phenotypic screening

• Auteur / Autrice : Véronique De Conto
• Direction : Vincent Bérézowski, Elodie Vandenhaute
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 21/12/2021
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Lille Neuroscience et Cognition (Lille)
• Jury : Président / Présidente : Jean Philippe Stephan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Émilie Dejean
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Catherine Villard, Hélène Castel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Techniques de culture cellulaire

Techniques in vitro

Tests de toxicité

Phénotype

méthodes

Évaluation préclinique de médicament

Maladies neurodégénératives

Matrice extracellulaire

Microenvironnement cellulaire

Cultures cellulaires

Tests de toxicité in vitro

Neurotoxicologie

Phénotype

Criblage pharmacologique

Maladies neurodégénératives

Matrice extracellulaire

Micro-environnement cellulaire

Mots clés libres

Microenvironnement

Matrice extracellulaire

Culture cellulaire en 3 dimensions

Neurotoxicité

Maladies neurodégénératives

Criblage phénotypique

Microenvironment

Extracellular matrix

3-dimensional cell culture

Neurotoxicity assessment

Neurodegenerative disease

Phenotypic screening

Résumé

Environ 90% des candidats-médicaments échouent en phase clinique, pour des raisons d’efficacité ou de toxicité qui impliquent souvent le système nerveux central (SNC). Ce fort taux d’échec souligne un manque de pertinence des modèles expérimentaux utilisés en amont, dont les modèles in vitro de cellules humaines. En effet, ces derniers ne prennent pas en compte toute la complexité du SNC, où les neurones organisés en 3 dimensions (3D) interagissent avec leur microenvironnement composé de cellules, de facteurs solubles et des molécules de la matrice extracellulaire (MEC). Les objectifs de ce travail étaient i) d’étudier l’influence de ces trois composantes du microenvironnement sur les cellules neuronales dans des modèles cérébraux in vitro par imagerie cellulaire automatisée, et ii) de développer des modèles cérébraux in vitro plus pertinents pour évaluer les effets neurotoxiques ou thérapeutiques de molécules par criblage phénotypique, notamment dans le cadre de la maladie de Parkinson (MP).Dans un premier temps, la technologie BIOMIMESYS® Brain a été développée. Cette matrice à base d’acide hyaluronique permet de mimer la MEC et de cultiver des cellules cérébrales en 3D dans des plaques 96 puits. La sensibilité des cellules Luhmes, une lignée de neurones dopaminergiques, aux inducteurs de la MP a été étudiée : les cellules ont montré une sensibilité plus faible dans BIOMIMESYS® Brain qu’en 2 dimensions (2D). Cette différence a pu être expliquée par deux phénomènes : une rétention partielle des molécules toxiques dans la matrice, et un phénotype de neurone dopaminergique moins mature qu’en 2D. L’importance du microenvironnement cellulaire a ensuite été étudiée au travers d’une co-culture de cellules Luhmes et d’astrocytes primaires humains en 2D. Cette co-culture a ensuite été transposée dans la matrice BIOMIMESYS®, formant ainsi un modèle complexe incluant à la fois le microenvironnement glial et le microenvironnement matriciel.En parallèle, l’influence du microenvironnement moléculaire a été étudiée sur les cellules SH-SY5Y, une lignée cellulaire issue d’un neuroblastome, couramment utilisée pour évaluer la neurotoxicité de molécules. Dans cette étude, les 24 principaux milieux décrits dans la littérature pour différencier ces cellules en neurones ont été criblés. Les 3 conditions les plus différenciantes en matière de ralentissement de la prolifération cellulaire et de croissance des neurites ont été sélectionnées : l’acide rétinoïque, la staurosporine, et l’Adénosine Monophosphate cyclique (AMPc) associée à du supplément B21. L’expression de marqueurs protéiques neuronaux et la sensibilité des cellules à des composés de toxicités connues ont été mesurées, en 2D et en 3D dans BIOMIMESYS® Brain. La maturité neuronale et la sensibilité aux composés neurotoxiques différaient selon le milieu, en étant les plus hautes en milieu B21+AMPc. La culture en 3D modifiait aussi la réponse des cellules, avec une sensibilité plus faible comparée aux cellules cultivées en 2D.Cette thèse a mis en évidence que le microenvironnement des neurones, qui inclut la MEC, les cellules gliales et les facteurs solubles, modifie la réponse neuronale in vitro et devrait par conséquent être considéré avec attention dans la recherche académique comme industrielle, dès les étapes de criblage de nouveaux médicaments.

About 90% of drug candidates fail in clinical trials, for efficacy- and toxicity-related reasons, which often involve the Central Nervous System (CNS). This high failure rate highlights a lack of relevance in experimental models used upstream, including human in vitro models. Indeed, they do not take into account the complexity of the CNS, in which neurons are organized in 3 dimensions (3D) and interact with their microenvironment, composed of cells, soluble factors and extracellular matrix (ECM). The objectives of this PhD were i) to study the influence of these three microenvironment components on neuronal cells in cerebral in vitro models by automatized cellular imaging, and ii) to develop more relevant cerebral in vitro models for phenotypic screening, to assess neurotoxic or therapeutic effects, in the frame of Parkinson’s Disease (PD).First, the BIOMIMESYS® Brain technology has been developed. This acid hyaluronic based-matrix allows the simulation of the ECM and a 3D culture of cerebral cells in 96-well plates. The sensitivity of Luhmes cells, a dopaminergic neuronal cell line, to PD inducers has been studied: the cells displayed a lower sensitivity in BIOMIMESYS® Brain compared to cells cultured in 2 dimensions (2D). This difference was explained by two phenomena: a partial retention of toxic molecules in the matrix, and a lower neuronal maturity compared to cells cultured in 2D.The importance of the cellular microenvironment has been studied through a co-culture of Luhmes cells and primary human astrocytes in 2D. This co-culture has then been transposed in BIOMIMESYS® matrix, to form a complex model including both the glial and the matricial microenvironments.In parallel, the influence of the molecular microenvironment has been studied on the SH-SY5Y cells, a cell line derived from a neuroblastoma, commonly used for neurotoxicity assessment. In this study, the 24 major differentiation media described in the literature to differentiate these cells into neurons have been screened. The 3 most differentiating conditions in terms of proliferation slowdown and neurite elongation have been selected: retinoic acid, staurosporine, and cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) combined to B21 supplement. The neuronal protein marker expression and the cell sensitivity to compounds of known-toxicity have been measured, in 2D and in 3D in BIOMIMESYS® Brain. Both maturity and sensitivity of these neurons varied according to the differentiation medium, and were higher in B21+cAMP. The 3D cell culture modified also the cell response, with a lower sensitivity of cells cultured in 2D.This PhD highlighted that the microenvironment of neurons, including the ECM, the glial cells and the soluble factors, can modify the neuronal response in vitro, and should thus be considered carefully in academic research and as early as possible in the drug discovery industrial process.