Nanobodies dirigés contre TAU en tant qu’outils moléculaires pour étudier l’immunothérapie dans la maladie d’Alzheimer et les troubles connexes

Nanobodies directed against TAU as molecular tools to investigate immunotherapy in Alzheimer’s disease and related disorders

• Auteur / Autrice : Orgeta Zejneli
• Direction : Luc Buée, Isabelle Landrieu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 29/09/2021
• Etablissement(s) : Université de Lille (2018-2021)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Lille ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Lille Neuroscience et Cognition (Lille) - Lille Neuroscience et Cognition (Lille)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Caroline Smet-Nocca, Kunie Ando-Roussel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Marc Dhenain, Efthimios Skoulakis

Mots clés

Mots clés contrôlés

Modèles animaux de maladie humaine

usage thérapeutique

Anticorps à domaine unique

Immunothérapie

Protéines tau

Agrégation pathologique de protéines

Tauopathies

thérapie

Maladie d'Alzheimer

Expérimentation animale

Modèles animaux

Anticorps à domaine unique

Protéine tau

Protéines -- Agrégation

Immunothérapie

Alzheimer, Maladie d'

Mots clés libres

Anticorps à domaine unique

Thérapie

Tauopathies

Maladie d'Alzheimer

Immunothérapie

Nanobodies

Therapy

Tauopathies

Alzheimer

Immunotherapy

Résumé

Tau est une protéine associée aux microtubules, bien connue pour réguler la dynamique du cytosquelette des neurones dans le cerveau. Bien que les mécanismes conduisant à l'agrégation de Tau dans les tauopathies sont encore mal définis, le peptide PHF6 est décrit comme un noyau d'agrégation de Tau. L'immunothérapie est proposée comme une approche thérapeutique dans les tauopathies. Cette stratégie est en effet efficace pour atténuer la pathologie Tau dans les modèles animaux. Cependant, il reste important de mieux définir plusieurs paramètres pour concevoir la meilleure stratégie en immunothérapie spécifique de Tau. Par exemple, même si l'accumulation intracellulaire d'agrégats de Tau en filaments hélicoïdaux appariés (PHF) sont les événements majeurs liés aux lésions neuropathologiques, la protéine Tau extracellulaire est considérée comme le facteur clé de la propagation et du “seeding” de la pathologie. Compte tenu des défis pour concevoir une immunothérapie spécifique de Tau efficace, nous avons utilisé des fragments d'anticorps appelés VHH (Variable domain of the Heavy-chain of the Heavy-chain-only-antibodies) car ils sont plus faciles à générer, sélectionner et modifier que les anticorps conventionnels. Il est intéressant de noter que les VHHs peuvent être utilisés pour des applications intracellulaires, en modifiant leur capacité à pénétrer dans les cellules ou par expression intracellulaire. Un VHH nommé Z70, liant le peptide PHF6, a été préalablement sélectionné, caractérisé et optimisé dans le laboratoire. VHH Z70 a la capacité de bloquer l’agrégation de Tau dans les tests in vitro. Sur cette base, la capacité de VHH Z70 à bloquer le “seeding” de Tau a été étudiée dans le modèle de souris transgénique THY-tau30. Pour cela, des LVVs (vecteurs lentiviraux) exprimant VHH Z70, VHH Z70 fusionné à mCherry, VHH Z70 fusionné à un fragment Fc d'immunoglobuline de souris (Minibody) et VHH anti-GFP pour contrôle négatif, ont été produits et injectés à des souris âgées d'un mois, dans la zone de l'hippocampe. Afin d'induire le processus d'agrégation endogène, des lysats de cerveaux humains atteints de la maladie d’Alzheimer ont ensuite été injectés. L'immunomarquage AT-8 a été choisi pour définir le niveau de la pathologie dans le cerveau. Les animaux injectés avec des LVVs exprimant VHH Z70 ont montré une tendance à la diminution de la pathologie Tau, mais cette tendance n'est devenue significative que dans le cas de VHH Z70 fusionné à mCherry. Pour les souris traitées avec des VHH exprimant le Minibody, l'analyse n'a révélé aucun changement chez les souris traitées, par rapport au contrôle négatif (Minibody VHH anti-GFP). Compte tenu de ces résultats prometteurs, des optimisations de l'activité VHH Z70 dans le compartiment intracellulaire ont été réalisées. La stratégie d'optimisation impliquait une mutagenèse aléatoire couplée à une sélection par double hybride de levure, réalisés par la société Hybrigenics, Paris. Huit variants fonctionnels ont été sélectionnés à partir de ce criblage avec une reconnaissance d'épitope conservée. La détermination de l'affinité par résonance plasmonique de surface suggère que la liaison de l'épitope peut être améliorée par des mutations situées à la fois dans les régions déterminantes complémentaires et dans les régions charpentes. Ces variantes ont été testées en comparaison avec VHH Z70 pour leur capacité à inhiber l'agrégation de Tau dans des cellules où l’agrégation est détectée sur base d’une fluorescence. Trois de ces mutants ont une activité inhibitrice in vitro qui correspond à VHH Z70 et pourraient être utilisés dans de futurs tests in vivo. Pour conclure, les résultats de ce projet de trois ans ont établi que VHH Z70 a le potentiel d'atténuer l'accumulation de Tau, au moins dans un modèle de souris. De plus, ces études ont démontré que les VHH spécifiques à Tau sont des outils moléculaires utiles pour déchiffrer les meilleures cibles dans les immunothérapies Tau.

Tau is a microtubule-associated protein, best known to regulate cytoskeletal dynamics of neurons in the brain. Although the mechanisms leading to Tau aggregation in tauopathies are still ill-defined, the peptide PHF6 is described as a nucleus of Tau aggregation. Immunotherapy is proposed as a therapeutic approach in tauopathies. This strategy is indeed effective in attenuating Tau pathology in animal models, improving also cognitive and motor functions. However, it remains important to better define several parameters to design the best strategy in Tau-specific immunotherapy. For example, even-though the intracellular accumulation of Tau aggregates into paired helical filaments (PHFs) are the major events connected to neuropathological lesions, extracellular tau is lately considered as the key driver in the spread and seeding of the pathology. In view of the challenges to design the most effective Tau-specific immunotherapy, we have used antibody fragments called VHHs (Variable domain of the Heavy- chain of the Heavy-chain-only-antibodies, or nanobodies) because they are easier to generate, select and engineered compared to conventional antibodies. Of interest, VHHs can be used for intracellular applications, by engineering their ability to penetrate the cells or by direct intracellular expression. A VHH named Z70, binding the PHF6 peptide, was previously selected, characterized and optimized in the laboratory. VHH Z70 has the ability to block Tau seeding in in vitro assays. Based on these results, VHH Z70 capacity of blocking Tau seeding was investigated in THY-tau30 transgenic mouse model. For this, LVVs expressing VHH Z70, VHH Z70 fused to mCherry, VHH Z70 fused to a Fc fragment of mouse immunoglobulin (Minibody) and VHH anti-GFP for negative control, were produced and injected to one-month old mice in the hippocampus area. Exogenous human Alzheimer’s disease brain lysates were subsequently injected to induce the endogenous aggregation process. AT-8 immunostaining was chosen to define the level of the pathology in the brain. Animals injected with LVVs (lentiviral vectors) expressing VHH Z70 showed a decreases tendency of the seeded Tau pathology, but this tendency became only significant in the case of VHH Z70 fused to mCherry. For the mice treated with VHHs expressing the Minibody, the immunohistochemistry analysis did not reveal any change in the treated mice, compared to the negative control (Minibody VHH anti-GFP). Given these promising results, optimizations of VHH Z70 activity in the intracellular compartment were performed. The strategy for optimization involved random mutagenesis coupled with yeast two-hybrid for selection, in partnership with Hybrigenics company. Eight functional variants were selected from this screen with conserved epitope recognition. Determination of the affinity by surface plasmon resonance suggested that the binding of the epitope can be improved by mutations located in both the complementary determining regions and the framework regions. These variants were further tested in comparison with VHH Z70 for their ability to inhibit Tau aggregation in fluorescence-based seeding reporter cells. Three of these mutants have an in vitro inhibitory activity that matched VHH Z70 and could be used in future in vivo assays. To conclude, the results of this three-year project have established that VHH Z70 has potential in mitigating Tau accumulation, at least in a mouse model of seeding. In addition, these studies demonstrated that the Tau-specific VHHs are useful molecular tools to decipher the best target in Tau immunotherapies.