Décryptage des interactions métaboliques en lait lors de l'évolution expérimentale d'un consortium de lactocoques et d'une communauté issue de lait cru seuls ou en association.

Metabolic interactions' decoding in milk during the experimental evolution of a lactococcal consortium and an undefined community from raw milk alone or in association.

• Auteur / Autrice : Marie-Aurore Caillaud
• Direction : Marie-Line Daveran, Hélène Tormo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénieries microbienne et enzymatique
• Date : Soutenance le 11/06/2021
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : TBI - Toulouse Biotechnology Institute, Bio & Chemical Engineering - Toulouse Biotechnology Institute / TBI
• Jury : Président / Présidente : Muriel Cocaign-Bousquet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marie-Line Daveran, Hélène Tormo, Christophe Lacroix, Eric Guedon, Nathalie Desmasures
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christophe Lacroix, Eric Guedon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lactocoques

Lait cru

Métabolisme

Mots clés libres

Evolution expérimentale

Interactions

Modélisation

Lactoccus lactis

Métabolisme

Lait cru

Experimental evolution

Interactions

Modelling

Lactococcus lactis

Metabolism

Raw milk

Résumé

Différents types d’interactions régissent les dynamiques de populations au sein des écosystèmes microbiens, permettant la cohabitation et l’évolution des microorganismes dans le temps et l’espace. L’étude de consortia synthétiques simplifiés constitue une approche de plus en plus utilisée pour décrypter les réseaux interactifs au sein des communautés naturelles. Parmi les interactions mises en place, les interactions métaboliques, très fréquemment présentes dans les écosystèmes alimentaires laitiers, peuvent être étudiées en conditions contrôlées, grâce à des descripteurs facilement mesurables car liés aux fonctionnalités technologiques de l’écosystème. L’espèce mésophile Lactococcus lactis, utilisée dans les fermentations laitières pour ses propriétés acidifiantes et aromatisantes, est caractérisée par une grande diversité génétique et phénotypique. Cette espèce est présente dans de nombreux habitats, comme les plantes ou les animaux. Ceux-ci sont de véritables réservoirs de souches « environnementales » aux capacités métaboliques très diverses pouvant notamment coloniser le lait cru. Si divers travaux ont étudié l’adaptation de souches pures de L. lactis dans le lait, peu ont considéré leur adaptation lorsqu’elles interagissent entre elles au sein d’un même écosystème, reflétant ainsi les conditions naturelles. Les travaux présentés dans cette thèse ont cherché à décrypter les interactions métaboliques au sein d’un consortium de trois souches de L. lactis, durant leur évolution adaptative en lait sur plus de 800 générations. La dynamique des souches au sein de ce consortium a été réalisée par PCR digitale (ddPCR), outil de traçage souche-spécifique ciblant des polymorphismes au sein du gène de ménage recN. Plus généralement, cet outil a été élargi à la détection des espèces L. lactis et L. cremoris et du biovar diacetylactis retrouvés dans les starters laitiers. Un modèle mathématique basé sur des descripteurs liés à la croissance microbienne et au métabolisme azoté et carboné, a été proposé dans le but d’expliquer la dynamique des souches au sein du consortium. La perte rapide d’une souche a soulevé l’hypothèse de l’absence d’interaction positive avec cette souche. Pour les deux autres souches, leur dynamique observée au sein du consortium au cours des 800 générations rend compte i) d’une inhibition par le lactate produit, ii) d’une coopération de type cross-feeding par les acides aminés, et iii) d’une adaptation des métabolismes carboné et azoté d’une souche durant l’évolution en lait. En parallèle de cette étude, l’évolution expérimentale de ce consortium a été réalisée en présence d’une communauté indéfinie issue d’un lait cru fermenté dans le but de mettre en évidence des interactions inter-espèces. L’analyse par metabarcoding de l’ADNr 16S de la communauté indéfinie a montré la prédominance de l’espèce Lactococcus lactis dès le début de l’évolution. Des capacités d’acidification efficaces et stables de cette communauté ont été mises en évidence au cours du temps. L’empreinte aromatique diacétyle/acétoïne, spécifique du consortium, a été retrouvée dans l’association ‘communauté indéfinie - consortium’, témoignant de la coévolution des deux communautés au cours du temps. Une analyse des composés organiques volatils issus de la fermentation de ces communautés évoluées a permis de mettre en évidence la présence d’un composé, le 2-methylthiolan-3-one, spécifiquement produit en plus grande quantité par l’association comparativement à chacune des communautés seules. Ces résultats ont permis de mettre en exergue de potentielles interactions métaboliques au sein de cette association, interactions certainement impliquées dans la robustesse du mélange au cours du temps. D’un point de vue technologique, ces interactions semblent conférer une valeur ajoutée au produit fermenté, avec une empreinte organoleptique spécifique combinant qualités technologiques (acidification) et spécificité aromatique issue du terroir.

Different types of interactions govern populations’ dynamics within microbial ecosystems, allowing microorganisms’ cohabitation and coevolution over time and space. Studying simplified synthetic consortia constitutes an approach more and more used to decipher the interactive networks within natural communities. Among existing interactions, metabolic interactions, usually encountered in dairy food ecosystems, can be studied under monitored conditions, thanks to easily measurable descriptors linked to the technological functionalities of the ecosystem. The Lactococcus lactis mesophilic species, implicated in dairy fermentations due to its acidifying and aroma compounds’ production capacities, is characterized by a large genetic and phenotypic diversity. This species may be found in various habitats, like plants or animals, these including “environmental” strains with multifarious metabolic capacities, being able to colonize raw milk environment. If several works studied the L. lactis strains’ adaptation in pure cultures, few have considered their adaptation when interacting together within the same ecosystem, thus reflecting natural conditions. These works aimed to decrypt metabolic interactions within a consortium of three L. lactis strains during their adaptive evolution in milk over more than 800 generations. Strains’ dynamics in the consortium was carried out with digital droplet PCR (ddPCR), a strain-specific tracking tool targeting polymorphisms within the recN housekeeping gene. This tool was expanded to the detection of the species L. lactis and L. cremoris and the biovar diacetylactis found in dairy starters. A mathematical model based on descriptors linked to the microbial growth and the carbon and nitrogen metabolisms was proposed in the aim to explain the strains’ dynamics within the consortium. The rapid loss of one strain raised the hypothesis of the absence of positive interaction with this strain. For the two other strains, their dynamics in the consortium over the 800 generations reports on i) an inhibition by the produced lactate, ii) a cooperation with a cross-feeding by amino acids, and iii) an adaptation of carbon and nitrogen metabolisms of one strain during the evolution in milk. In parallel with this study, the experimental evolution of this consortium was carried out in the presence of an undefined community from a fermented raw milk to highlight inter-species interactions. The metabarcoding analysis of the 16S rDNA from the undefined community showed the predominance of the Lactococcus lactis species from the beginning of the evolution. Efficient and stable acidification capacities of this community were highlighted over time. The diacetyl/acetoin aroma footprint, characteristic of the consortium, was found in the association ‘undefined community – consortium’, testifying of the two communities’ coevolution over time. Volatile organic compounds’ analysis from fermentations of these evolved communities showed the presence of a compound, the 2-methylthiolan-3-one, specifically produced in larger amounts by the association than by each community alone. These results brought out potential metabolic interactions leading to the mixture’s robustness over time. From a technological perspective, these interactions seem conferring a benefit to the fermented product, with a specific organoleptic footprint combining technological qualities (acidification) and aromatic specificity associated with the terroir.