L'étude de la lipoprotéine à basse densité par microscopie électronique et diffusion neutronique

Studies of low-density lipoproteins by cryo-electron microscopy and neutron scattering

• Auteur / Autrice : Aline Cisse
• Direction : Judith Peters
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique pour les sciences du vivant
• Date : Soutenance le 09/12/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble, Isère, France ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (Grenoble, Isère, France ; 1966-....)
• Jury : Président / Présidente : Elisabeth Charlaix
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Ruth Prassl, Giovanna Fragneto, Marc Jamin
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Aurélie Bertin, Jörg Pieper

Mots clés

Mots clés contrôlés

Neutrons -- Diffusion

Apolipoprotéine B

Lipoprotéines de basse densité

Mots clés libres

Dynamique

Microscopie électronique

Structure

Diffusion de neutrons

Dynamics

Cryo-EM

Structure

Neutron scattering

Résumé

Les lipoprotéines à basse densité (LDL) jouent un rôle crucial dans le métabolisme du cholestérol. Responsables de son transport du foie vers les organes, leur accumulation dans les artères est à l’origine de maladies cardiovasculaires, telles que l’athérosclérose. Constituées d’un cœur composé de cholestérol, dans sa forme libre ou estérifié, ainsi que de triglycérides, les LDL sont entourées d’une membrane de phospholipides, ainsi que d’une protéine immense : l’apolipoprotéine B-100 (apo B-100). Sur la LDL, la protéine contient des parties exposées en surface, et d’autres partiellement incorporées dans la membrane. Apo B-100 est impliquée dans de nombreuses fonctionnalités de la LDL, comme la réception des LDL par les organes, ou la conversion des VLDL (lipoprotéines à très basse densité) en LDL.Dans ce contexte, ce travail de thèse s’est concentré sur plusieurs questions fondamentales, qui sont encore peu étudiées : Quelle est la structure d’une LDL et où se trouve la protéine apo B-100 ? Quelle est la dynamique moléculaire d’apo B-100 ?Dans un premier volet, la dynamique d’apo B-100 a été étudiée par diffusion incohérente élastique et quasi-élastique de neutrons (EINS, QENS), des techniques qui permettent d’accéder à des échelles de temps de la picoseconde à la nanoseconde. De par la nature de apo B-100, et des conséquences de son extraction, les mesures ont donné lieu à de nouvelles problématiques. En effet, l’échantillon final inclut à la fois apo B-100, mais aussi le détergent utilisé pour sa solubilisation ; Nonidet P-40 (NP40). Hors, les mesures de diffusion incohérente intègrent toutes les contributions des atomes d’hydrogène, à la fois la protéine ou le détergent. Pour séparer les contributions, et apporter une solution à un problème qui ne se rencontre pas seulement dans le cas d’apo B-100, mais plus généralement avec les protéines membranaires, nous avons construit un nouveau modèle pour analyser les données QENS. Nous avons ainsi mis en évidence l’accélération de la dynamique interne de NP40 en présence de apo B-100, par comparaison aux mesures sur NP40 pur. En outre, nous avons pu quantifier la dynamique moléculaire d’apo B-100. Avec cette méthodologie, nous espérons ouvrir la voie à plus d’études dynamiques en diffusion de neutrons sur des systèmes comme les protéines membranaires, où la présence de détergent doit être prise en compte.En parallèle des travaux sur la dynamique, nous avons exploré la structure des LDL entières par cryo-microscopie électronique (cryo-EM), avec ces objectifs en tête : améliorer la qualité des cartes 3D de LDL au vu des récentes évolutions techniques, et localiser la protéine apo B-100 à la surface de la LDL. En cryo-EM, les images des LDL servent de base pour reconstruire une carte 3D. Comme les orientations des LDL ne sont pas connues a priori, la reconstruction 3D s’appuie sur différents logiciels de reconstruction, tels que RELION et cryoSPARC. Leur application a d’abord permis de quantifier plus précisément les couches de cholestérol estérifié observées dans le cœur des LDL à basse température, et nous proposons un modèle révisé de bicouches. Concernant la localisation de apo B-100, notre carte soutient le modèle actuel dans lequel apo B-100 « ceinture » la LDL. Néanmoins, elle n’a pas permis d’obtenir des détails sur la protéine, comme des hélices alpha ou feuillets bêta, ce qui indique que apo B-100 serait extrêmement flexible sur la LDL, une propriété qui n’était pas un consensus dans la communauté des LDL jusqu’ici. La présence de lipides, couplée à une importante flexibilité de apo B-100, font de la reconstruction à haute résolution de la LDL et de apo B-100 un véritable défi, qui ne peut pas encore être résolu avec les outils actuels. En mettant en ligne nos données brutes, et en présentant l’état de nos travaux actuels, nous espérons amorcer de nouvelles discussions en cryo-EM, et l’émergence de nouveaux algorithmes pour reconstruire de tels complexes.

Low-density lipoproteins (LDL) play a crucial role in the metabolism of cholesterol in the blood. Responsible for its transport from the liver to the organs, their accumulation in the arteries is the cause of cardiovascular diseases, such as atherosclerosis. Consisting of a core composed of cholesterol, in its free or esterified form, as well as triglycerides, LDL is surrounded by a membrane of phospholipids, as well as a huge protein: apolipoprotein B-100 (apo B-100). On LDL, the protein contains parts exposed on the surface, and others partially incorporated into the membrane. Apo B-100 is involved in many functionalities of LDL, such as the reception of LDL by organs, or the conversion of VLDL (very low density lipoproteins) into LDL.In this context, this thesis work focused on several fundamental questions, which are still scarcely studied: What is the structure of LDL and where is the apo B-100 protein located? What are the molecular dynamics of apo B-100?In a first part, the dynamics of apo B-100 was studied by elastic and quasi-elastic incoherent neutron scattering (EINS, QENS), techniques that allow access to time scales from picosecond to nanosecond. Due to the nature of apo B-100, and the consequences of its extraction, the measurements gave rise to new questions. Indeed, the final sample includes both apo B-100, but also the detergent used for its solubilization; Nonidet P-40 (NP40). However, incoherent scattering measurements integrate all the contributions of hydrogen atoms, both from the protein and the detergent. To separate the contributions, and to solve a problem that is not only found in the case of apo B-100, but more generally for membrane proteins, we built a new model to analyze the QENS data. From there, we highlighted the acceleration of the internal dynamics of NP40 in the presence of apo B-100, compared to measurements on pure NP40. Furthermore, we were able to quantify the molecular dynamics of apo B-100. With this methodology, we hope to pave the way for more dynamical studies with neutron scattering on systems such as membrane proteins, where the presence of detergent must be taken into account.In parallel to the dynamical investigation, we explored the structure of whole LDL by cryo-electron microscopy (cryo-EM), with these objectives in mind: to improve the quality of 3D maps of LDL in view of the recent technical developments, and to localize the apo B-100 protein on LDL’s surface. In cryo-EM, LDL images are used as a basis to reconstruct a 3D map. As the orientations of LDL are not known a priori, the 3D reconstruction relies on different algorithms, implemented in software packages, such as RELION and cryoSPARC. Their application first allowed us to quantify more precisely the esterified cholesterol layers observed in the LDL core at low temperature, and we propose a revised bilayer model. Regarding the localization of apo B-100, our map supports the current “belt” model in which apo B-100 encircles LDL. Nevertheless, the map did not provide details about the protein, such as alpha helices or beta sheets, indicating that apo B-100 should be extremely flexible on LDL, a property that was not a consensus in the LDL community until now. The presence of lipids, coupled with significant flexibility of apo B-100, makes high-resolution reconstruction of LDL and apo B-100 a real challenge, which cannot yet be solved with current tools. By making our raw data available online, and by presenting the state of our current work, we hope to initiate new discussions in cryo-EM, and the emergence of new algorithms to reconstruct such complexes.