Cristallisation des protéines membranaires avec une plateforme microfluidique automatisée

Crystallization of membrane proteins with an automated microfluidic pipeline

• Auteur / Autrice : Sofia Jaho
• Direction : Monika Budayova-Spano
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique pour les sciences du vivant
• Date : Soutenance le 08/06/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale physique (Grenoble ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Wim Burmeister
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mirjam Czjzek, Jean-Baptiste Salmon, William Shepard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ahmed Haouz, Sébastien Teychené

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cristallisation

Protéines membranaires

Mots clés libres

Puces microfluidique

Cristallographie en série

Protéines membranaires

Croissance des cristaux

Diagramme de phases

Crisyallisation de dialyse

Microfluidic chips

Serial crystallography

Membrane proteins

Crystal growth

Phase diagram

Dialysis crystallization

Résumé

Une puce microfluidique a été développée, combinant les avantages de la technologie microfluidique et de la méthode de cristallisation par microdialyse, permettant un contrôle précis et réversible des paramètres expérimentaux de la cristallisation sur puce. Des micropuces avec un volume maximal de réservoir de protéines de 0.1 µL et 0.3 µL ont été développées. Un petit morceau de membrane de dialyse en cellulose régénérée est incorporé entre deux couches de la puce. La coupure du poids moléculaire de la membrane peut être choisie en fonction du poids moléculaire de l'échantillon de protéine et de la solution de précipitant. La dialyse offre une trajectoire cinétique qui permet une exploration étendue du diagramme de phase et elle peut être utilisée en combinaison avec le contrôle de la température pour découpler la nucléation de la croissance cristalline, tandis qu'une multitude de conditions de cristallisation peut être criblée avec le même échantillon de protéine.Deux protéines solubles modèles (le lysozyme du blanc d'œuf de poule (HEWL) et la thaumatine de Thaumatococcus danielli) et quatre protéines membranaires (AcrB d'Escherichia coli, ShuA de Shigella dysenteriae, SERCA d'Oryctolagus cuniculus et TmPPase de Thermotoga maritima) ont été cristallisées sur puce et utilisées pour des expériences de diffraction in situ des rayons X à température ambiante. Le bruit de fond généré par l'interaction des rayons X avec les matériaux composant la puce a été évalué, rendant les puces compatibles avec la collecte des données de diffraction in situ. Des cartes de densité électronique détaillées ont été produites pour les cristaux de HEWL à une résolution supérieure à 2 Å. De plus, des ensembles de données de diffraction partiels ont été collectés à partir de nombreux petits cristaux de thaumatine et de cristaux de HEWL cultivés sur la puce avec la méthode de cristallisation en phase cubique lipidique (LCP), vérifiant la compatibilité de la puce pour la cristallographie sérielle aux rayons X (SSX) in situ au synchrotron. Comme attendu, dans le cas des protéines membranaires, la cristallisation sur puce était plus difficile. Cependant, les cristaux de toutes les quatre protéines membranaires testées ont été produits sur les puces. Les cristaux de SERCA ont diffracté avec une résolution proche de 7 Å, ce qui donne pour l’instant la meilleure résolution acquise sur notre puce avec des cristaux de protéines membranaires.Une plateforme (MicroCrys) a été développée pour automatiser la cristallisation sur puce par microdialyse afin d'étudier les diagrammes de phase par le biais de la composition chimique et du contrôle de la température. La plate-forme contribue à l'objectif global d'optimisation et de rationalisation de la cristallisation des protéines. Tous les composants séparés de la plateforme sont contrôlés par un logiciel LabVIEW personnalisé. De plus, un système fluidique commercial (Elveflow), pour mélanger et faire circuler la solution de cristallisation, a été incorporé dans la plateforme. Ce système fluidique permet l'échange des solutions de cristallisation dans le canal fluidique de la puce. Une étude qualitative du diagramme de phase de HEWL a été réalisée en faisant germer, croître, dissoudre et ré-germer des cristaux de HEWL sur la puce dans de différentes concentrations de précipitant. Enfin, un prototype de régulation thermique utilisant l'effet Peltier a été développé. Un programme LabVIEW a été écrit pour l'acquisition et l'affichage en temps réel de la valeur de la température au niveau du réservoir de protéine de la puce. Une fois que le système de régulation thermique et le système fluidique sous pression seront intégrés dans le logiciel principal de la plateforme, MicroCrys sera une plateforme entièrement automatisée et conviviale pour les expériences de cristallisation sur puce.

A microfluidic chip has been developed coupling the advantages of the microfluidic technology and the microdialysis protein crystallization method allowing for accurate, fine-tuned and reversible control over the experimental parameters of the on chip crystallization. Microchips with 0.1 µL and 0.3 µL maximum volume of the protein reservoir have been developed for the on chip crystallization of proteins via microdialysis. Dialysis is based on the diffusion and equilibration of the precipitant molecules through a semi-permeable membrane. A small piece of regenerated cellulose dialysis membrane is embedded within two layers of the chip. The molecular weight cut off of the membrane can be chosen according to the molecular weight of the protein sample and the precipitant solution. Dialysis offers a kinetic trajectory that allows an extensive exploration of the phase diagram and it can be used in combination with temperature control to decouple nucleation from crystal growth, while a multitude of crystallization conditions can be screened with the same protein sample.Two model soluble proteins (Hen Egg White Lysozyme (HEWL) and Thaumatin from Thaumatococcus danielli) and four membrane proteins (AcrB from Escherichia coli, ShuA from Shigella dysenteriae, SERCA from Oryctolagus cuniculus and TmPPase from Thermotoga maritima) were crystallized on chip with the microdialysis method and used for room temperature in situ X-ray diffraction experiments. The background noise generated by the interaction of X-rays with the materials comprising the dialysis chip was evaluated, rendering the chips compatible with in situ X-ray data collection. Detailed electron density maps were produced for HEWL crystals at a resolution higher than 2 Å. Moreover, partial diffraction data sets were collected from numerous, small Thaumatin crystals and HEWL crystals grown on chip with the lipidic cubic phase (LCP) crystallization method, verifying the compatibility of the chip for in situ synchrotron serial X-ray crystallography (SSX). As expected, in the case of membrane protein targets, on chip crystallization was more challenging. However, the crystals of all four membrane proteins tested were produced on the dialysis chips. SERCA crystals diffracted close to 7 Å, which gives the best resolution so far acquired with membrane protein crystals on our chip.A platform (MicroCrys) has been developed to automate the on chip crystallization via microdialysis for investigating phase diagrams through chemical composition and temperature control. The platform contributes to the overall goal of optimizing and rationalizing protein crystallization. All the separate components of the platform are controlled by a custom-built LabVIEW software displaying a user-friendly graphical interface. Moreover, a commercial fluidic system (Elveflow) for mixing and circulating the crystallization solution has been incorporated in the platform. This fluidic system contributes to the automation of the on chip crystallization via microdialysis allowing the exchange of crystallization solutions in the fluidic channel of the chip. A qualitative study of the HEWL phase diagram was performed by nucleating, growing, dissolving and re-nucleating HEWL crystals on chip in different precipitant concentrations using MicroCrys and the pressure-driven fluidic system. Finally, a prototype for thermal regulation using the Peltier effect has been developed to couple the on chip microdialysis with temperature control. A LabVIEW program has been written for real-time acquisition, displaying and recording of the temperature value at the protein reservoir of the chip. Once, the thermal regulation system and the pressure-driven fluidic system will be integrated into the main software of the platform, MicroCrys will be a fully-automated, user-friendly platform for on chip crystallization experiments.