Structure et propriétés épigénetiques de la chromatine

Structure and epigenetic properties of chromatin

• Auteur / Autrice : Sunil Nahata
• Direction : Jan Bednar, Thierry Gautier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie du développement oncogenèse
• Date : Soutenance le 07/12/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut pour l'avancée des biosciences (Grenoble, Isère, France ; 2016-....)
• Jury : Président / Présidente : Johannes Geiselmann
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jan Bednar, Thierry Gautier, Christophe Papin
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Francesca Palladino, Pierre Jalinot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nucléosomes

Schizosaccharomyces pombe

Hétérochromatine

Chromatine

Histones

Empreintes génomiques

Génome

Mots clés libres

Organisation du génome

Histone

Chromatine

Hétérochromatine

Schizosaccharomyces pombe

Nucléosome crosslinking

Genomic organization

Histone

Chromatin

Heterochromatin

Schizosaccharomyces pombe

Nucleosome crosslinking

Résumé

Les chromosomes sont densément compactés dans les noyaux des cellules eucaryotes. Cette compaction implique un enchaînement d’étapes intermédiaires à différentes échelles génomiques tout au long du cycle cellulaire. Ces étapes intermédiaires fournissent un mécanisme d'organisation efficace du génome en compartiments fonctionnels au sein du noyau. Au niveau le plus simple, l'ADN existe dans le noyau sous la forme d'une double hélice, environ 147 pb de cet ADN à double hélice s'enroule autour de l'octamère d'histone de cœur. Cet arrangement d'ADN et d’histone est appelée nucléosome, ces nucléosomes sont liés les uns aux autres grâce à l’histone de liaison. Cet arrangement conduit au niveau primaire de compactage du génome, donnant ainsi naissance à la structure typique de « billes sur une chaîne» de fibre de chromatine avec des nucléosomes séparés par un ADN de liaison. La structure atomique d'un nucléosome a été résolue par cristallographie aux rayons X. En revanche, les niveaux d'organisation supérieurs de la fibre de chromatine sont à ce jour relativement mal caractérisés, ils sont très controversés et restent une boîte noire. De nombreuses spéculations ont été faites au fil des ans sur la topologie réelle de la fibre de chromatine avec plusieurs modèles proposés pour prédire le repliement des structures d'ordre supérieur de la fibre de chromatine à l'échelle de la fibre de 30 nm comme observé in vitro. Cependant, l'existence de cette structure secondaire d'ordre supérieur de la fibre de chromatine reste controversée et son existence in vivo est fortement contestée. Au cours des deux dernières décennies, la famille des techniques de capture de conformation chromosomique (3C) a considérablement transformé notre compréhension de l'organisation du génome à grande échelle. Pourtant, notre compréhension de l'architecture de la chromatine au niveau de la structure secondaire reste incomplète en raison de la méthodologie de réticulation employée par les méthodes basées sur 3C qui a le potentiel de capturer des interactions aléatoires et/ou distantes qui pourraient ne pas refléter le véritable état du génome.Dans cette étude, nous avons développé une méthode appelée « Capture du nucléosome voisin le plus proche » (3NC) qui tire parti de la réticulation spécifique au site entre les nucléosomes spatialement proximaux pour cartographier l'architecture de la chromatine à une résolution du nucléosome. Nous avons utilisé cette technique pour l’analyse du génome de la levure Schizosaccharomyce pombe. Avec 3NC, nous avons non seulement capturé avec succès les interactions de nucléosomes révélant les caractéristiques du repliement de la chromatine qui ont été identifiées avec des techniques récentes basées sur 3C, mais nous avons également démontré des différences significatives dans les interactions de nucléosomes à divers loci génomiques, une caractéristique que les techniques basées sur 3C n'ont pas réussi à capturer jusqu'à présent. Avec l'émergence de preuves que l'organisation structurelle du génome joue un rôle fonctionnel sur l'expression des gènes qui pourrait conduire à des troubles du développement, il devient encore plus important de cartographier l'architecture du génome, en particulier à l'échelle de la chromatine. Par conséquent, 3NC en tant que technique, nous offre l'opportunité d'étudier la structure secondaire de la fibre de chromatine, d'identifier les états intermédiaires de la chromatine, et d'étendre potentiellement son application aux systèmes mammifères pour disséquer le rôle de la structure de la chromatine dans la régulation des gènes pour le maintien d’une bonne santé humaine ou au cours de développement des maladies.

Chromosomes are densely packaged within the nuclei of eukaryotic cells. This packaging involves a series of hierarchical intermediate steps at varying genomic scales throughout the cell cycle. These intermediate steps provide a mechanism of efficiently organizing the genome into functional compartments within the nucleus. At the simplest level, DNA exists within the nucleus as a double helix and ~147 bp of this double helical DNA wraps around the core histone octamer. This combination of DNA and histone protein complex is termed as a nucleosome core particle (NCP). The NCP bound to the linker histone (chromatosome) is connected to other chromatosomes through a linker DNA. This arrangement leads to the primary level of genome compaction, giving rise to the typical “beads on a string” structure of chromatin fiber. The atomic structure of the nucleosome, the NCP and the chromatosome, have already been deciphered through structural techniques. In contrast, the higher levels of organization of the chromatin fiber are relatively poorly characterized to date, are highly controversial and remain a black box. A great deal of speculation has been made over the years about the actual topology of the chromatin fiber with multiple models proposed to predict the folding of the higher order structures of the chromatin fiber at the 30 nm scale as observed in vitro. However, the existence of this higher order secondary structure of the chromatin fiber remains controversial, and its existence in vivo is highly disputed. In the last two decades, the family of chromosome conformation capture (3C) techniques has tremendously transformed our understanding about the organization of genome at a global scale. Yet, our understanding of chromatin architecture at the level of secondary structure remains incomplete due to the crosslinking methodology employed by 3C based methods which has the potential to capture random and/or distant interactions which might not reflect the true genomic state.In this study, we have developed a method called “Nearest Neighbouring Nucleosome Capture” (3NC) which takes advantage of site-specific crosslinking between spatially proximal nucleosomes to map chromatin architecture at a nucleosome resolution. We have applied this method to study the genome organization in fission yeast Schizosaccharomyces pombe. With 3NC we have not only successfully captured nucleosome interactions revealing characteristics of chromatin folding which have been identified with recent 3C based techniques, but also demonstrate significant differences in nucleosome interactions at various genomic loci, a feature which 3C based techniques have failed to capture so far. With the emergence of evidence that structural organization of the genome plays a functional role on gene expression and might lead to developmental disorders, it becomes even more significant to map out the genome architecture, especially at the scale of chromatin. Therefore, 3NC as a technique, provides us with an opportunity to study the secondary structure of chromatin fiber, identifying intermediate states of chromatin, and to potentially extend its application to mammalian systems for dissecting the role of chromatin structure in gene regulation in human health and disease.