Biocapteur polyvalent pour décrypter les activités glycoenzymatiques

Versatile biosensor for deciphering glycoenzymatic activities

• Auteur / Autrice : Daniel Márquez-Martín
• Direction : Didier Gasparutto
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie biologie
• Date : Soutenance le 16/03/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Systèmes moléculaires et nanomatériaux pour l’énergie et la santé (Grenoble, Isère, France ; 2008-....)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Renaudet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Didier Gasparutto, Carole Chaix
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Muriel Bardor, Carmelo Di Primo
• DOI : 10.70675/44437e70z51bfz440czae47zbaff1fc1edb7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Résonance plasmonique de surface

Biocapteurs

Glycosyltransférases

Mots clés libres

Glycosyltransférase

Biocapteur

Imagerie SPR

Adn

Ddi

Glycosyltransferase

Biosensor

SPR imaging

Dna

Ddi

Résumé

À ce jour, les glycosyltransférases (GT) sont une famille essentielle d'enzymes mal caractérisées à la fois structurellement et mécaniquement, ce qui constitue une limitationmajeure dans le domaine des glycosciences. Ces enzymes jouent un rôle crucial dans les organismes vivants en catalysant le transfert stéréo- et régio-spécifique d'un sucre donneur activé vers une molécule acceptrice, pour construire des oligosaccharides complexes à la surface des cellules. La mise au point de nouveaux outils analytiques est nécessaire pour analyser et caractériser les interactions entre ces enzymes et les glycanes, dans une approche à haut débit. Dans ce contexte, l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi) apparait comme une méthodologie adaptée et polyvalente pour répondre à cette demande de criblage de ligands et desuivi des interactions biomoléculaires, en temps réel et sans marquage.Par conséquent, ce projet de recherche multidisciplinaire est organisé en trois axes principaux : dans un premier temps, nous abordons l'expression hétérologue et la purification d'une fucosyltransférase de la plante Arabidopsis thaliana (AtFUT1) qui participe à la dernière étape de la biosynthèse du ligand xyloglucan (XyG). Ensuite, les approches d'immobilisation spécifiques des résidus glycanes sur surface ont motivé la conception de stratégies chimiosélectives pour conjuguer les entités XyG à des échafaudages oligonucléotidiques avec de bons rendements. La polyvalence des structures ODN conjuguées aux glycanes fournit des informations et propriétés précieuses pour les étapes de purification et de caractérisation des glycanes, ainsi quepour leur immobilisation. Enfin, le troisième axe est consacré à la conception et à la construction d'une glyco-puce XyG polyvalente, par une approche d'immobilisation spécifique dirigée par l'ADN (DDI). Cette stratégie conduit au développement final d'un outil analytique original basé sur la puissante technique SPRi, qui permet la visualisation et la caractérisation des interactions biomoléculaires en temps réel et sans marquage.

To date, glycosyltransferases (GTs) are an essential family of enzymes poorly characterized both structurally and mechanistically which is being a major bottleneck in Glycoscience. They play a crucial role in living organisms catalysing the stereoand regiospecific transfer of an activated donor sugar to an acceptor moiety to build up complex oligosaccharides onto the cell surface. New analytical tools are required to screen enzyme-glycan interactions in high-throughput manner. In this context, Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) has spread as a versatile methodology to overcome this glycoscientific demand for ligands screening and biomolecular interaction monitoring at real time and without any labels.Therefore, this multidisciplinary project is organized in three main axes: first, we address the heterologous expression of a fucosyltransferase from the plant Arabidopsis thaliana (AtFUT1) (CAZy family GT37) that participates in the last step in the biosynthesis of xyloglucan (XyG) ligand. Then, specific immobilization approaches using DNA architectures motivate the design of chemoselective strategies to conjugate XyG building-blocks to oligonucleotidic scarfolds in good yields. The versatility of having ODN structures conjugated to glycans provides powerful insights for glycan purification, characterization and also immobilization approaches on solid support. In this matter, the third axis is dedicated towards the conception and construction of a versatile XyG glycochip for its specific immobilization approach by DNA-Directed Immobilization (DDI). This strategy is envisioned through the powerful SPRi technique that allows the simultaneous visualization of binding events without using any label molecule in real time measurements.