Synthèse d'oligomères du peptidoglycane pour l'étude du métabolisme de la paroi bactérienne

Peptidoglycan oligomers synthesis to study the bacterial cell wall metabolism

• Auteur / Autrice : Antoine Rousseau
• Direction : Sébastien Fort
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie
• Date : Soutenance le 16/12/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de recherches sur les macromolécules végétales (Grenoble ; 1966-....)
• Jury : Président / Présidente : Boris Vauzeilles
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sébastien Fort, Catherine Bougault, Stéphane Mesnage
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Boris Vauzeilles, Mirjam Czjzek

Mots clés

Mots clés contrôlés

Ingénierie métabolique

Résistance aux antibiotiques

Oligomères

Mots clés libres

Oligomères du peptidoglycane

Glycosynthase

Ingénierie métabolique

Synthèse chimio-Enzymatique

Antibiorésistance

Peptidoglycan oligomers

Glycosynthase

Metabolic engineering

Chemo-Enzymatic synthesis

Antibiotic resistance

Résumé

Le peptidoglycane (PG) est un biopolymère complexe constitué de chaînes polysaccharidiques reliées entre elles par des segments peptidiques. Les chaînes de glycanes sont formées par la répétition de dimères de N-acétyl-D-glucosamine (GlcNAc) et d’acide N-acétyl-D-muramique (MurNAc) liés par des liaisons β(1→4). Absent chez les mammifères, le PG est un composant essentiel de la paroi bactérienne. Il forme un réseau tridimensionnel robuste entourant la cellule et assurant une protection mécanique nécessaire à son intégrité. Tout défaut dans l’assemblage de cette paroi est dommageable, voire fatal pour la bactérie. Ainsi, la majorité des antibiotiques utilisés chez l’Homme ciblent spécifiquement les enzymes de biosynthèse du PG afin de bloquer la croissance bactérienne. Néanmoins, l’utilisation excessive d’antibiotiques est à l’origine de l’apparition et de la propagation de bactéries résistantes. Faute de découverte de nouvelles molécules depuis plusieurs décennies, l’antibiorésistance est devenue un problème de santé majeur qui pourrait causer plus de 10 millions de décès par an en 2050, devenant ainsi une menace plus grande que le cancer. Les mécanismes d’antibiorésistance sont souvent associés à des mutations d’enzymes impliquées dans la biosynthèse du PG. Afin de mieux comprendre comment les bactéries échappent à l’action des antibiotiques et de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques, l’étude des enzymes impliquées dans le métabolisme du PG et plus particulièrement dans l’antibiorésistance est donc nécessaire. L’accès à des substrats et à des sondes moléculaires parfaitement définis est un enjeu de recherche majeur. La synthèse d’oligomères du PG reste cependant extrêmement difficile et à ce jour seules quelques équipes à travers le monde ont réalisé des synthèses chimiques multi-étapes particulièrement complexes.L’objectif de cette thèse a été de développer de nouveaux outils permettant la synthèse d’oligomères du peptidoglycane de taille et de structure parfaitement contrôlées par des approches chimio-enzymatiques et microbiologiques. Pour cela, nous avons d’abord transformé le lysozyme du blanc d’œuf de poule, une glycoside hydrolase qui hydrolyse naturellement le peptidoglycane, en glycosynthase. Cette nouvelle enzyme a été conçue afin de réaliser l’oligomérisation du motif de répétition disaccharidique du PG. En parallèle, deux nouvelles voies d’accès complémentaires au précurseur GlcNAc-MurNAc ont été mises au point. La première est une approche chimique basée sur la modification régiosélective du chitinbiose. La seconde repose sur l’ingénierie métabolique de la voie de recyclage du peptidoglycane chez Escherichia coli afin de produire le disaccharide in vivo. Finalement, l’utilisation de la glycosynthase et de ce précurseur a permis de synthétiser efficacement et rapidement les oligomères du PG jusqu’à l’octamère avec un parfait contrôle de leur taille. Ces molécules sont actuellement engagées dans des études structurales et fonctionnelles des enzymes impliquées dans le métabolisme de la paroi bactérienne.

Peptidoglycan (PG) is a complex biopolymer made of polysaccharide chains which are cross-linked by peptide bridges. Glycan chains are formed by the repetition of dimeric units made of N-acetylglucosamine (GlcNAc) and N-acetylmuramic acid (MurNAc) linked by β(1→4) bonds. PG is an essential and specific component of the bacterial cell wall which is needed to confer osmotic stability and morphological robustness to the cell throughout the bacterial life cycle. Any defect during the cell wall assembly is harmful, indeed lethal for the bacteria. Therefore, given that PG is not found in mammals, most antibiotics used in human medicine target peptidoglycan biosynthesis enzymes and prevent bacterial growth. However, the excessive use of antibiotics and lack of new active molecules have led to the emergence and spread of resistant bacteria. For many decades, antibiotic resistance has been rising to dangerously high levels all over the world. It is estimated to be responsible for 700,000 deaths a year and unless action is taken, this figure could rise to 10 million by 2050. This projection would make antibiotic resistance a bigger threat than cancer. As major antibiotic resistance mechanisms are associated with mutations in enzymes involved in the PG metabolism, in-depth structural and functional analyses of these key biocatalysts are essential to develop new antibiotics. This work requires the use of substrates or molecular probes with perfectly defined structures. The synthesis of PG oligomers is a complex task and to date, only few groups worldwide have addressed this work, mainly by chemical approaches requiring numerous steps.In this context, this PhD thesis aimed at developing innovative chemo-enzymatic and microbiological methodologies to produce PG oligomers in quantities allowing biochemical and structural studies. First, Hen egg-white lysozyme, a well-known peptidoglycan-degrading enzyme has been converted into a glycosynthase and this new enzymatic tool has enabled the oligomerization of the PG disaccharide motif. In the meantime, we have developed two new straightforward accesses to the GlcNAc-MurNAc precursor. The first one is a chemical approach based on the regioselective modification of chitinbiose. The second one relies on the metabolic engineering of the peptidoglycan recycling pathway of Escherichia coli in order to produce the disaccharide in vivo. Finally, by using the glycosynthase and the precursor, we have implemented a chemo-enzymatic synthesis of PG oligomers up to the octamer with perfect control over their size. These molecules are currently used to carry out functional and structural analyses of the bacterial cell wall enzymatic machinery.