Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirales

Structural and functional analysis of Bunyavirales replication and transcription

• Auteur / Autrice : Benoît Arragain
• Direction : Guy Schoehn
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 17/09/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe microscopie électronique et méthodes (Grenoble)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Breyton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Guy Schoehn, Félix Rey, Stephen Cusack
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Célia Plisson-Chastang, Bruno Canard

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN -- Réplication

Infections à bunyaviridés

Bunyaviridés

Virus à ARN négatif

Mots clés libres

Virus

Cryo-Microscopie électronique

Nucléocapside

Polymérase virale

Réplication

Transcription

Virus

Cryo-Electron microscopy

Nucleocapsid

Viral polymerase

Replication

Transcription

Résumé

L’ordre des Bunyavirales englobe plus de 450 espèces de virus à ARN négatif segmenté (sNSV). Répandus dans le monde entier et considérés comme émergents, l’infection de l'homme par certains Bunyavirus peut entrainer de graves maladies. Chez la famille des Hantaviridae, le virus Hantaan (HTNV) provoque des fièvres hémorragiques tandis que chez les Peribunyaviridae, le virus La Crosse (LACV) entraine des cas d’encéphalites chez les enfants. De plus, l’ordre des Bunyavirales est proche d’autres sNSV comme le virus influenza (Orthomyxoviridae), un agent infectieux responsable d’épidémies saisonnières.Les génomes d’HTNV et de LACV sont constitués de trois segments codant pour quatre protéines structurales : les glycoprotéines (Gn et Gc), encodées sur le segment M, la nucléoprotéine (NP), encodée sur le segment S et la polymérase, aussi appelée protéine L, encodée sur le segment L. Au cours d’une infection, les NPs protègent le génome viral des dégradations et de la réponse immunitaire innée de la cellule infectée en multimérisant autour du génome viral. Ces complexes protéine-ARN forment des assemblages hélicoïdaux appelés nucléocapsides (NC). Les extrémités 5′ et 3′ de chacun des segments du génome viral (ARNv) sont liées à une protéine L. Le complexe L-NP-ARN, appelé particule ribonucléoprotéique (RNP), représente l’unité fonctionnelle nécessaire à la réalisation de deux étapes essentielles à la suite de l’infection virale : la réplication et la transcription des trois segments qui composent l’ARNv.La réplication de l’ARNv débute par la production d’un génome viral complémentaire (ARNc) en prenant l’ARNv comme modèle, suivie de la genèse de nouveaux ARNv, en se basant sur les ARNc. La protéine L, et en particulier son domaine ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp), joue un rôle central dans cette réaction. Au cours de l’infection, la protéine L permet également d’initier la production d’ARN messagers codant pour les quatre protéines virales. Pour cela, elle « vole » à la cellule infectée un segment d'ARN coiffé en 5′ via son domaine de liaison de la coiffe (CBD). Cet ARN coiffé est ensuite clivé par un domaine endonucléase (ENDO) également présent au sein de la protéine L et permettant in fine d’initier la synthèse de l'ARN messager (ARNm) viral au niveau de son domaine RdRp : c’est la transcription.Actuellement, il n’existe aucun traitement pour combattre les infections dues à ces virus. Il est donc crucial d'analyser les étapes essentielles de leur cycle viral décrites ci-dessus afin de comprendre leur mécanisme de fonctionnement et de potentiellement permettre le développement de nouveaux traitements antiviraux.L’objectif global de cette thèse était donc de tirer profit des derniers développements en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) afin de caractériser au niveau structural puis au niveau fonctionnel, deux acteurs majeurs de la réplication et de la transcription chez les Bunyavirus en utilisant comme modèle d’étude les NPs et les protéines L de HTNV et LACV. Au cours de cette thèse, j’ai tout d’abord déterminé la structure à haute résolution de la nucléocapside recombinante du HTNV (HTNV-NC) afin de caractériser les différentes interactions entre les NPs et de comprendre le mécanisme d’encapsidation de l’ARNv au sein des HTNV-NCs. Puis, j’ai déterminé les structures à résolution quasi-atomique de la protéine L du HTNV (HTNV-L) et du virus La Crosse (LACV-L) en complexe avec les régions promotrices 5’ et 3’ de l’ARNv. Enfin, j’ai caractérisé fonctionnellement LACV-L via la mise en place de tests d’activités réalisés in vitro. Ceci a permis de bloquer LACV-L à plusieurs étapes clés de la réplication et de la transcription, un prérequis qui m’a permis de déterminer sept structures à haute résolution de LACV-L en action. La combinaison de ces instantanés structuraux montre avec grande précision les mécanismes moléculaires sous-tendant la réplication et la transcription des Peribunyavirus.

The Bunyavirales order encompasses over 500 species of segmented negative stranded RNA viruses (sNSV). Widespread throughout the world and considered as emerging viruses, the infection of humans by bunyaviruses can lead to serious diseases. In the Hantaviridae family, hemorrhagic fevers have been reported after Hantaan virus (HTNV) infection, while in the Peribunyaviridae family, La Crosse virus (LACV) infections have resulted in cases of encephalitis in children. In addition, the order Bunyavirales is related to other sNSVs such as influenza virus (Orthomyxoviridae), an infectious agent responsible for seasonal epidemics.The genomes of HTNV and LACV consist of three segments that encode four structural proteins: the glycoproteins (Gn and Gc), encoded on the M segment, the nucleoprotein (NP), encoded on the S segment and the polymerase, also known as L protein, encoded on the L segment. During infection, NPs protect the viral genome from damage and against innate immune response of the infected cell by multimerizing around the viral genome. These protein-RNA complexes form helical assemblies called nucleocapsids (NC). Both the 5' and 3' ends of each segment of the viral genome (vRNA) are respectively bound to an L protein. Interactions between L, NP and vRNA form a circularized complex called ribonucleoprotein (RNP). The RNPs present in the virus are the functional units that perform the replication and the transcription of each of the three viral segments.The replication of the vRNA first consists in the production of the complementary genome (cRNA) using vRNA as template, followed by the generation of new vRNA based on the cRNA template. The L protein, and in particular its RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) region, plays an essential role in this reaction. During infection, the L protein also initiates the production of messenger RNAs that encode viral proteins. It first “steals” a 5' capped RNA segment from the infected cell via its cap-binding domain (CBD). This capped RNA is then cleaved by an endonuclease domain (ENDO) also present in the L protein, which ultimately initiates the synthesis of viral messenger RNA (mRNA) thanks to the RdRp catalytic domain: this is transcription.Currently, there is no treatment to counteract bunyavirus infections. It is therefore crucial to analyze the essential steps of their viral cycle described above in order to understand their mechanism of operation and potentially allow the development of new antiviral treatments.The overall objective of this thesis was to take advantage of cryo-electron microscopy to structurally and functionally characterize two major actors of replication and transcription in bunyaviruses, NPs and L proteins, using HTNV and LACV as models. I first determined the high-resolution structure of the recombinant HTNV nucleocapsid (HTNV-NC) to characterize the different interactions between the different NPs and understand the mechanism of encapsidation of the vRNA within the HTNV-NCs. Secondly, I determined the cryo-EM structures of both HTNV and LACV L proteins (respectively called HTNV-L and LACV-L) in complex with the 5' and 3' promoter regions. Finally, I performed the functional characterization of LACV-L via the implementation of in vitro activity assays. This enabled to stall LACV-L in several key stages of both replication and transcription, a pre-requisite that permitted the determination of seven high-resolution structures of LACV-L in action. The combination of these structural snapshots shows with unprecedented details the mechanisms underlying peribunyaviruses replication and transcription.