Mécanismes de stabilisation des microtubules : rôle du nucléotide lié à la tubuline et action des protéines associées aux microtubules

Mechanisms of microtubule stability : role of the nucleotide bound to tubulin and effects of microtubule associated proteins

• Auteur / Autrice : Nassiba Bagdadi
• Direction : Isabelle Arnal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 08/09/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des neurosciences de Grenoble
• Jury : Président / Présidente : Laurence Paturle-Lafanechère
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Arnal, Laura Schaedel
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christian Poüs, François Devred

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie de fluorescence

Protéine tau

GTP

Stabilité

Microtubules

Mots clés libres

Microtubules

Stabilité

Tubuline-GDP

Tau

Microscopie TIRF

Systèmes purifiés

Microtubules

Stability

GDP-Tubulin

Tau

Tirf

Cell-Free system

Résumé

Les microtubules sont des polymères biologiques dynamiques impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que la migration, le transport intracellulaire et le maintien de la morphologie des cellules. Ils alternent aléatoirement entre des phases de polymérisation et de dépolymérisation, un comportement appelé l’instabilité dynamique. Dans les cellules différenciées, les microtubules dynamiques coexistent avec des microtubules stables qui possèdent un très faible taux échange (« turn-over ») de tubuline. Ces microtubules stables sont essentiels pour maintenir la morphologie et la fonction des cellules. En conditions pathologiques, l’équilibre entre microtubules dynamiques et stables est perturbé, altérant ainsi les fonctions cellulaires. A ce jour, les bases moléculaires de la stabilité des microtubules restent encore peu connues. Il est admis que certaines des protéines associées aux microtubules (MAPs), telles que la protéine neuronale Tau, stabilisent directement les microtubules. Les modifications post-traductionnelles de la tubuline quant à elles permettent de renforcer une stabilité préexistante.Durant ma thèse, j’ai étudié deux mécanismes de stabilisation des microtubules, l’un dépendant d’un effecteur microtubulaire, la protéine neuronale Tau, et l’autre dépendant uniquement des propriétés de la tubuline. Dans une première partie de mon travail, j’ai développé une méthode pour caractériser la cinétique de l’interaction entre la protéine Tau et des microtubules. J’ai utilisé pour cela des systèmes reconstitués à partir de protéines purifiées et la visualisation de molécules uniques en vidéo-microscopie à fluorescence TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence). Cette approche permettra d’étudier comment des modifications de Tau modulent son interaction avec les microtubules, et ainsi réguler sa capacité à stabiliser les microtubules. Dans la deuxième partie de ma thèse j’ai montré que la tubuline associée au GDP peut s’assembler en microtubules, contrairement au dogme général qui stipule que les microtubules ne polymérisent qu’à partir de tubuline associée au GTP. Ces nouveaux microtubules possèdent des propriétés uniques jamais décrites. En effet, ils sont dépourvus d’instabilité dynamique et sont très stables. Par ailleurs, ils polymérisent préférentiellement par l’extrémité (–) du microtubule qui normalement constitue l’extrémité la moins active en présence de tubuline-GTP. De plus, j’ai démontré que des îlots stables de tubuline-GDP sont capables de stopper la dépolymérisation des microtubules. Certains effecteurs cellulaires comme la protéine Tau et DCX favorisent l’assemblage de la tubuline-GDP. D’autres effecteurs comme la spastine et la kinésine MCAK permettent de recycler les microtubules formés à partir de tubuline-GDP mais moins efficacement que ceux formés à partir de tubuline-GTP. La meilleure compréhension de ce nouveau type de stabilisation pourra fournir des pistes pour le développement de nouvelles stratégies dans le but de restaurer et/ou préserver les microtubules stables en conditions pathologiques.

Microtubules are biological dynamic polymers involved in numerous cellular processes such as cell migration, intracellular transport and cell morphology. They alternate between polymerization and depolymerization phases, a behavior named dynamic instability. In differentiated cells, dynamic microtubules coexist with stable microtubules which exhibit a slow tubulin exchange rate (“turn-over”). These stable microtubules are essential for the maintenance of cell morphology and cellular functions. In pathological conditions, the equilibrium between dynamic and stable microtubules is disturbed, thus altering cellular functions. Today, the molecular bases of microtubule stability are still not fully understood. It is widely accepted that some microtubule associated proteins (MAPs), such as the neuronal protein Tau, stabilize directly the microtubules. However, as for the post-translational modifications of tubulin, MAPs mainly reinforce a pre-existing stability of microtubules.During my thesis, I studied two stabilization mechanisms of microtubules: one mechanism dependent on a microtubular effector, the neuronal protein Tau, and the other solely dependent on tubulin properties. In the first part of my work, I developed a method to characterize the kinetic parameters of the interaction between Tau and microtubules. To do so, I used cell-free systems reconstituted from purified proteins and TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) microscopy that allows to visualize single fluorescent molecules. This approach will enable to study how modifications of Tau modulate its interaction with microtubules and thus its capacity to regulate microtubule stabilization. In the second part of my thesis, I have shown that tubulin associated to GDP can assemble into microtubules, contrary to general dogma stipulating that microtubules can only polymerize from tubulin associated to GTP. These new species of microtubules have unique properties, never described before. Indeed, they are devoid of dynamic instability and are highly stable. Moreover, they polymerize preferentially from the microtubule (–) end which usually is the least active end when microtubules are assembled from GTP-tubulin. Furthermore, I have demonstrated that stable GDP-tubulin islands can stop microtubule depolymerization. Some cellular effectors such as the neuronal proteins Tau and DCX promote GDP-tubulin assembly. Other effectors such as spastin and the kinesin MCAK enable to recycle microtubules assembled from GDP-tubulin, but less efficiently than the ones assembled from GTP-tubulin. Better understanding of this new type of stabilization involving the nucleotide bound to the tubulin during its polymerization could provide leads for the development of new strategies for restoration and/or preservation of stable microtubules in pathologies.