Etudes structurales de complexes anticorps-antigène multispécifiques par cryo-microscopie électronique

Structural studies of multispecific antibody-antigen complexes by cryo-electron microscopy

• Auteur / Autrice : David Fernandez-Martinez
• Direction : Gordon Leonard, Magali Mathieu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 31/03/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European synchrotron radiation facility (Grenoble, Isère, France ; 1988-....) - Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Nicole Thielens
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Gordon Leonard, Sergio Marco, José María Valpuesta, Jan Steyaert
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julie Bouckaert, Nushin Aghajari

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticorps bispécifiques

Cryomicroscopie

Cryoélectronique

Mots clés libres

Antigène

Cryo-EM

Bispécifique

Antigen

Cryo-EM

Bispecific

Résumé

La microscopie cryoélectronique (cryo-EM) a connu une montée en puissance et en popularité ces dernières années. En effet, les progrès du matériel et des logiciels ont permis la détermination de structures à des résolutions élevées (<4 Å). Cela a permis l'exploration de la cryo-EM comme outil pour élucider les interactions anticorps-antigène dans des conditions quasi-natives, une avancée importante pour la recherche pharmaceutique. Dans le domaine des anticorps thérapeutiques, les anticorps multispécifiques, qui sont conçus pour se lier à deux ou plusieurs cibles, sont actuellement du plus grand intérêt. Malheureusement, il n'y a actuellement aucune publication d’étude cryo-EM à haute résolution d'anticorps entiers, ou d'interfaces anticorps-antigène dans le contexte de l'anticorps complet. Ainsi, les principaux objectifs de cette thèse étaient doubles : 1) La mise en place d'un protocole, de la préparation des échantillons à la structure, pour les études cryo-EM d'anticorps entiers, qui servira de point de départ à de futurs projets dans ce domaine ; 2) L'utilisation de la cryo-EM pour élucider à haute résolution les détails des interfaces antigène-anticorps multispécifiques dans le contexte de l'anticorps complet. Ces travaux ont ciblé trois anticorps : CODV (bispécifique), TBTI (bispécifique) et TDT (trispécifique), avec un fort accent sur le CODV et ses complexes avec les petits antigénes IL4 et IL13.Les premiers travaux (chapitre 1) se sont concentrés sur la préparation, la purification et la caractérisation biophysique d'anticorps individuels et de complexes CODV-antigène. Ici, les études SPR ont montré que CODV se lie à ses deux antigènes IL4 et IL13 avec une affinité picomolaire et que cette affinité est indépendante de l'ordre de liaison ou des effets de position.Des expériences préliminaires de microscopie électronique à coloration négative (NSEM) (chapitre 2) ont fourni des informations sur la qualité et la dispersion des échantillons et ont permis la détermination de reconstructions à basse résolution. Les expériences NSEM ont suggéré un niveau élevé de flexibilité et d'hétérogénéité conformationnelle des anticorps, en particulier au niveau du Fc. De plus, les reconstructions obtenues pour les complexes CODV-antigène n'ont montré aucune densité correspondant aux antigènes.En raison des avantages thérapeutiques du format et de sa priorité pour Sanofi, le système CODV a ensuite été utilisé pour la mise en place d’un protocole de cryo-EM (chapitre 3). Des stratégies de préparation de grille ont d'abord été explorées afin de limiter l'agrégation des anticorps CODV et leur aversion pour les supports conventionnels. Des jeux de données Cryo-EM pour apo-CODV, CODV-IL4 et CODV-IL4 / IL13 ont ensuite été collectés au microscope Titan Krios 300 keV de la ligne de lumière ESRF CM01. Le traitement de ces données a confirmé à la fois l'absence apparente d'antigènes liés à CODV et la forte hétérogénéité conformationnelle de l'anticorps déjà observée dans les expériences NSEM. Ceci signifie que seules des reconstructions à très faible résolution, parfois incomplètes, pouvaient être obtenues.Une stratégie de réduction de la flexibilité conformationnelle a donc été proposée. Cela comprenait le marquage de l'antigène IL13 avec du tralokinumab, un anticorps anti-IL13 (chapitre 3). Un complexe ternaire CODV-IL13-Tralokinumab a donc été préparé et purifié. Les expériences NSEM ont révélé la présence de densité pour IL13 et des expériences de cryo-EM basées sur le protocole développé ont été réalisées. Celles-ci ont abouti à une reconstruction à résolution moyenne (3.93 Å) de l'interface CODV-IL13-Tralokinumab, suggérant que cette stratégie de marquage peut être utilisée dans d'autres études. Ce travail ouvre donc la voie à de futures études cryo-EM des complexes anticorps-antigène, en particulier pour celles où la présence de Fc est essentielle pour le bon contexte biologique, comme l'opsonisation ou la dégranulation cellulaire.

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has experienced a surge in capability and popularity in recent years. In particular, advances in hardware and software have allowed the imaging of the structures at progressively higher resolutions (<4 Å). This has enabled the exploration of cryo-EM as a tool for elucidating antibody-antigen binding interactions in near-native conditions. This would be an invaluable step forward in drug discovery. In the field of antibody therapeutics, multispecific antibodies, which are engineered to bind to two or more targets, are currently of the highest interest. Unfortunately, there are currently no reports of high resolution cryo-EM studies of whole antibodies, or of antibody-antigen interfaces, within the full-antibody context. Thus, the main goals of this thesis were two-fold: 1) The establishment of a pipeline, from sample preparation to structure, for whole antibody cryo-EM studies, that will serve as a starting point for future projects in the field; 2) The use of cryo-EM to elucidate, at close to atomic level, details of multispecific antibody-antigen interfaces within the full-antibody context. This work targeted three antibodies: CODV (bispecific), TBTI (bispecific) and TDT (trispecific), with a strong focus on CODV and its complexes with the small antigen ligands IL4 and IL13.Initial work (Chapter 1) concentrated on the preparation, purification and biophysical characterization of individual antibodies and of CODV-antigen complexes. Here, SPR studies showed that CODV binds to both of its IL4 and IL13 antigens with picomolar affinity and that this affinity is independent of binding order or positional effects.Preliminary negative-stain electron microscopy (NSEM) experiments (Chapter 2) provided information concerning sample quality and dispersion and allowed the production of low-resolution reconstructions for potential use in cryo-EM analysis. The NSEM experiments suggested a high level of flexibility and conformational heterogeneity of the antibodies, especially at the Fc level. Intriguingly, the reconstructions obtained for CODV-antigen complexes did not show any density corresponding to the antigens.Due to the therapeutic advantages of the format and its priority within the antibody development efforts of Sanofi, the CODV system was then used for cryo-EM pipeline development (Chapter 3). Grid preparation strategies were first explored in order to ameliorate on-grid aggregation of CODV antibodies and their aversion for conventional supports. Cryo-EM datasets for apo-CODV, CODV-IL4 and CODV-IL4/IL13 were then collected at the Titan Krios 300 keV microscope at the ESRF CM01 beamline. Processing of these datasets confirmed both the apparent absence of antigens bound to CODV and the high conformational heterogeneity of the antibody observed in NSEM experiments. The latter meant that only very low resolution, and sometimes incomplete, reconstructions of CODV and its antigen complexes could be obtained.A strategy to reduce the conformational flexibility was therefore proposed. This comprised labelling the IL13 antigen with Tralokinumab, an anti-IL13 antibody (Chapter 3). A ternary CODV-IL13-Tralokinumab complex was therefore prepared and purified. NSEM experiments revealed density for IL13 and cryo-EM experiments based on the pipeline developed was therefore carried out. These resulted in a medium-resolution reconstruction (3.93 Å) of the CODV-IL13-Tralokinumab interface, suggesting that this labelling strategy can be used in other studies. This work therefore paves the way for future cryo-EM studies of antibody-antigen complexes, especially in those where the presence of Fc is key for the correct biological context, such as opsonization or cell degranulation.