Thèse soutenue

Caractérisation structurale du cycle de transcription de la polymérase grippale
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Auteur / Autrice : Joanna M. Wandzik
Direction : Stephen Cusack
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie Structurale et Nanobiologie
Date : Soutenance le 24/02/2021
Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European molecular biology laboratory (Grenoble)
Jury : Président / Présidente : Rob W. H. Ruigrok
Examinateurs / Examinatrices : Stephen Cusack, Hélène Malet, Christoph W. Müller
Rapporteurs / Rapporteuses : Aartjan te Velthuis, Jonathan Grimes

Mots clés

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Résumé

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Les virus influenza sont un groupe d’agents pathogènes qui causent la grippe, une maladie infectieuse qui représente un risque majeur pour la santé des populations vulnérables. À ce jour, les stratégies de vaccination et de traitements antiviraux existants se montrent insuffisants pour adresser pleinement les enjeux de la maladie.L’enzyme clé responsable de la réplication du génome virale est l'ARN polymérase ARN-dépendante (FluPol). Lors de la transcription, les ARN messagers (ARNm) viraux qui portent une coiffe et une queue poly(A) à leurs extrémités 5’ et 3’ respectives sont synthétisés. La transcription virale commence par l'acquisition d'une amorce ARN par un mécanisme unique appelé cap snatching et est suivie de divers changements conformationnels au cours de la synthèse de l'ARNm. Jusqu'à présent, les événements dynamiques lors de la transcription, y compris le mécanisme de polyadénylation, étaient peu compris au niveau moléculaire.Pour étudier la polymérase de la grippe « en action », le projet a consisté en les étapes suivantes : (1) expression et purification des protéines ; (2) conception d’une série de mini-matrices ARN virales (mini-vRNA) qui portent les caractéristiques nécessaires telles que le signal de polyadénylation et les séquences conservées dans leur extrémités 3’ et 5’ ; (3) optimisation des conditions de transcription in vitro avec un essai qui repose sur l’incorporation de nucléotides radioactifs ; (4) séquençage ARN des produits de FluPol afin de valider l’approche employée ; (5) optimisation des échantillons, collecte et analyse des données microscopiques afin de résoudre les structures atomiques à haute résolution correspondant aux étapes successives de la transcription virale.Les travaux de thèse présentent une série de huit structures à haute résolution et décrivent au niveau moléculaire un cycle complet de transcription virale. Dans un premier temps, ce modèle détaillé montre la trajectoire de la matrice virale lors de la translocation et dévoile le rôle d’interaction de l’extrémité 3’ de la matrice avec un site secondaire sur la polymérase. Un tel site a été observé par d’autres, mais ces nouvelles structures permettent seulement maintenant de dévoiler son rôle. Ensuite, la comparaison de deux structures de terminaison sur différentes mini-matrices d'ARN, portant la séquence signal de polyadénylation native ou mutée, a permis de mieux comprendre le mécanisme de polyadénylation, unique pour cette classe de virus à ARN. Enfin, une fois le produit ARNm dissocié, la matrice d’ARN reste enfilée à l'intérieur de la polymérase et ne peut être libérée que par un changement majeur de la conformation de la FluPol. À la fin d'un cycle de transcription, les deux extrémités de la matrice virale restent liées à la FluPol dans leurs sites respectifs, ce qui assure une protection contre la dégradation et permet un recyclage efficace et le lancement du cycle de transcription suivant sans dissociation du complexe ARN-protéine.Grâce aux résultats obtenus, il a été démontré que plusieurs cycles de transcription peuvent être menés par une seule copie de l’ARN polymérase sans la dissociation de la matrice virale. Cela démontre non seulement le rôle fondamental de la polymérase grippale lors de l’infection, mais aussi souligne qu’elle est une cible importante pour le développement d’inhibiteurs viraux. Ce mécanisme semble également être conservé pour d'autres virus à ARN, des sites analogues ayant été observés dans les polymérases des bunya- et des arénavirus. D’autre part, la méthodologie développée au cours de cette thèse présente des structures à des résolutions sans précédent (allants jusqu’à 2.4 Å) qui permettent notamment de visualiser des molécules d’eau, ouvrant une voie pour la découverte d’inhibiteurs puissants de la polymérase grippale par cryo-EM.