Etude de la glycolyse vésiculaire en situation saine et dans la maladie de Huntington

Study of vesicular glycolysis in health and Huntington's Disease

• Auteur / Autrice : Maximilian Mc cluskey
• Direction : Frédéric Saudou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences neurobiologie
• Date : Soutenance le 04/02/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des neurosciences de Grenoble
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Arnal
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hervé Dubouchaud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Carine Bossenmeyer-Pourié, Frédéric Darios

Mots clés

Mots clés contrôlés

Chorée de Huntington

Lactate-déshydrogénases

Glycolyse

Mots clés libres

Glycolyse

Lactate deshydrogénase

Transport vésiculaire

Maladie de Huntington

Vesicular transport

Huntington's Disease

Lactate dehydrogenase

Glycolysis

Résumé

L'axone permet le déplacement électriques et chimiques sur de longues distances d'informations entre les neurones, un processus qui est à la base de la communication neuronale et de la fonction cérébrale. Cette information est transportée en partie par des vésicules. Les moteurs moléculaires liés à la membrane propulsent ces vésicules le long du cytosquelette de l’axone en consommant de l’ATP. Le laboratoire de Frédéric Saudou a montré précédemment que l'ATP nécessaire à ce transport est produit par des enzymes glycolytiques liées à ces membranes, créant ainsi un microenvironnement énergétiquement autonome pour le transport vésiculaire. De plus, le transport de BDNF est considérablement réduit dans la maladie de Huntington (MH), une maladie génétique causée par une expansion anormale de répétition de CAG dans le gène de la huntingtine (HTT). Cela conduit à un support trophique insuffisant du BDNF au striatum où il joue normallement un rôle crucial dans la survie cellulaire. La HTT est connu pour être une protéine d’échaffaudage pour les moteurs moléculaires sur les vésicules. Les objectifs de ce projet étaient donc de concevoir une approche permettant la mesure de l'activité glycolytique sur les vésicules afin de comprendre les subtilités de l'activité glycolytique sur les vésicules ainsi que d'identifier le lien entre glycolyse vésiculaire et transport insuffisant charactéristique de la MH.Pour ce faire, nous avons d'abord voulu décrire les différences de taux métaboliques et d'efficacité entre la glycolyse cytosolique et vésiculaire. Pour mesurer l'activité glycolytique, nous avons décidé de scinder la voie en deux segments: le premier a été déterminé par la production de NADH, le produit de GAPDH; et le deuxième segment a été mesuré par la production d'ATP, produite par PGK et PK. Grâce à ces mesures, nous avons constaté que la glycolyse vésiculaire a une plus grande affinité pour ses substrats que le cytosol, ce qui rend la vésicule plus efficace pour produire du NADH et de l'ATP que ses équivalents cytosoliques.Cela nous a alors conduit à nous interroger sur l'importance du recyclage de NAD sur les vésicules. Ici, nous avons montré, par immunofluorescence et western blot, que la LDH, enzyme responsable de la conversion du pyruvate en lactate et de l'oxydation du NADH, est également liée aux vésicules. En outre, nous avons démontré que ce recyclage NAD-dépendant de la LDH est crucial pour l'activité glycolytique globale sur les vésicules et requis pour le transport du BDNF dans des neurones corticaux en culture. Par conséquent, les vésicules axonales produisent de l'ATP par glycolyse aérobie, de manière similaire à l'effet Warburg décrit dans les cellules cancéreuses.Enfin, nous avons étudié le lien entre la glycolyse vésiculaire et le transport de BDNF dans la MH. Nous avons montré que le HTT interagit plus fortement sur les vésicules avec au moins deux enzymes glycolytiques, GAPDH et PFK, et que la quantité et l'activité de l'enzyme glycolytique sur les vésicules sont affectées dans la MH. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé la construction TM-GAPDH décrite précédemment pour stimuler artificiellement la glycolyse spécifiquement sur les vésicules ce qui nous a permis de démontrer que cette approche était suffisante pour restaurer le transport in vitro. Ceci est une prevue de l'importance de la glycolyse vésiculaire dans le transport du BDNF et la pathogenèse de la MH.

The axon enables long distance travel of electrical and chemical information between neurons, a process at the basis of neuronal communication and brain function. This information is transported in part by vesicles. Membrane-bound molecular motors propel these vesicles along the axon’s cytoskeleton by consuming ATP. The lab has shown previously that the ATP required for this transport is produced by on-board glycolytic enzymes, thus creating an energetically autonomous microenvironment for vesicular transport. What is more, the transport of BDNF is significantly reduced in Huntington’s disease (HD), a genetic disease caused by an abnormal CAG repeat expansion in the huntingtin (HTT) gene. This leads to insufficient trophic support of BDNF to the striatum where it plays a crucial role in cell survival. HTT is known to scaffold and mediate molecular motors on vesicles. The objectives of this PhD project were therefore to, design an approach to measure glycolytic activity on vesicles in order to understand the intricacies of glycolytic activity on vesicles as well as to identify the link between vesicular glycolysis and insufficient transport in HD.To do so, we first wanted to describe the differences in metabolic rates and efficiency between cytosolic and vesicular glycolysis. To measure glycolytic activity, we decided to split the pathway into two segments: the first was determined through the NADH production, the product of GAPDH; and the second segment was measured through the ATP production, produced by PGK and PK. Through these measurements, we found that vesicular glycolysis has a greater affinity for its substrates than the cytosol, making the vesicle more efficient at producing NADH and ATP than cytosolic equivalents.This then led us to question the importance of NAD recycling on vesicles. Here we showed, through immunofluorescence and western blot, that LDH, the enzyme responsible for converting pyruvate into lactate and oxidizing NADH in the process, is a vesicle-bound enzyme. Furthermore, we demonstrated that this LDH-dependent NAD recycling is crucial for overall glycolytic activity on vesicles and required for BDNF transport in cultured cortical neurons. Hence, axonal vesicles produce ATP via aerobic glycolysis, similarly to the Warburg effect in certain cancer cells.Finally, we studied the link between vesicular glycolysis and BDNF transport in HD. We showed that HTT interacts more strongly on vesicles with at least two glycolytic enzymes, GAPDH and PFK, and that glycolytic enzyme quantity and activity on vesicles is affected in HD. Based on these results we used previously described TM-GAPDH to artificially stimulate glycolysis specifically on vesicles to demonstrate that this approach was sufficient to restore transport in vitro. This provides evidence of the importance of vesicular glycolysis in BDNF transport and HD pathogenesis.