La réparation par excision de nucléotides – Nouvelles approches pour l'exploration de sa très large spécificité de substrat

Nucleotide Excision Repair : New Approaches to investigate its exceptionally broad substrate specificity

• Auteur / Autrice : Anna Seck
• Direction : Joanna Timmins, Jean-Luc Ravanat
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 19/01/2021
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Eric Defrancq
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Joanna Timmins, Anna Campalans, Sylvie Sauvaigo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bertrand Castaing, Arjan De Groot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Nucléotides

Irradiation

ADN -- Réparation

Mots clés libres

D. radiodurans

Système in vitro

Réparation par Excision de Nucléotides

D. radiodurans

In vitro system

Nucleotide Excision Repair

Résumé

La voie de réparation par excision nucléotidique (NER) est responsable de l'élimination de lésions très distinctes structurellement et chimiquement. Ces lésions qui sont généralement volumineuses peuvent provoquer des distorsions de la double hélice de l'ADN. Elles sont introduites dans le génome par des facteurs exogènes comme l'irradiation UV ou divers cancérogènes. La reconnaissance de substrats aussi diversifiés par les protéines Uvr dans les bactéries, est encore en grande partie incompris. Pour répondre à cette question, nous avons développé un test d'incision in vitro utilisant le système NER de la bactérie résistante aux radiations, Deinococcus radiodurans, composé de 4 protéines: UvrA1, UvrB, UvrC et UvrD. L’hélicase UvrD n’est pas essentielle pour l’incision. Contrairement aux études antérieures qui utilisaient des protéines Uvr de bactéries thermophiles, la reconstitution de ce système UvrABC repose sur l'utilisation de protéines purifiées à partir d'une même bactérie mésophile. L'activité d'incision a été évaluée soit sur des oligonucléotides d'ADN courts contenant des bases modifiées, soit sur de l'ADN plasmidique traité avec différents agents génotoxiques.Dans cette étude, nous avons optimisé le test d'incision et déterminé les composants minimaux et leurs concentrations optimales nécessaires pour une réparation efficace des lésions volumineuses. Ce test a permis d'explorer la spécificité de substrat du NER bactérien notamment en déterminant la nature et l'abondance des lésions réparées par les protéines Uvr par HPLC-MS/MS, la cinétique de réparation et la nature du produit libéré résultant du clivage du substrat. Nos données révèlent des différences nettes dans la réparation des différents substrats. Le test d'incision a également été utilisé pour mieux appréhender le rôle des différents domaines de la protéine UvrC dans le processus de réparation, qui reste l'une des étapes les plus énigmatiques du NER. Dans l'ensemble, ces études ont éclairci plusieurs aspects de cette voie de réparation et fournissent à la communauté scientifique un outil puissant pour de futures études.Mots clés: UvrABC, Réparation par Excision de Nucléotides, lésions de l'ADN, Deinococcus radiodurans, agents génotoxiques, HPLC-MS/MS.

The Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is responsible for the removal of a wide range of structurally and chemically variable bulky lesions causing minor to important distortions to the DNA helix. These lesions can be introduced by exogenous factors like UV-irradiation or diverse carcinogens. How such a diverse set of lesions are recognized and removed by just a small set of proteins, the Uvr proteins in bacteria, remains largely misunderstood. To address this question, we have developed an in vitro incision assay using the NER system from the radiation resistant bacterium, Deinococcus radiodurans, composed of 4 proteins: UvrA1, UvrB, UvrC and the DNA helicase UvrD, which is dispensable for the incision activity. In contrast to earlier studies that have made use of Uvr proteins from thermophilic bacteria, the reconstitution of the UvrABC system relied on the use of purified proteins from a single, mesophilic bacterium. The incision activity was evaluated on either short DNA oligonucleotides containing modified bases or on plasmid DNA treated with a number of damaging agents.In this study, we have optimized the incision assay and determined the minimal components and their optimal concentrations needed for efficient repair of bulky lesions. This assay has enabled us to explore the substrate specificity of bacterial NER notably by determining the nature and abundance of lesions repaired by the Uvr proteins by HPLC-MS/MS, the kinetics of repair and the nature of the released product resulting from the dual cleavage reaction. Our data reveal clear differences in the extent of processing of different substrates. The incision assay was also used to decipher the role of the different domains of UvrC in the repair process, which remains one of the most enigmatic steps of NER. Overall, these studies have shed light on several aspects of this repair pathway and provide the scientific community with a powerful tool for future studies.Keywords: UvrABC, Nucleotide Excision Repair, DNA lesions, Deinococcus radiodurans, damaging agents, HPLC-MS/MS.